לאחרונה, קרטינוציטים אוראליים משכו תשומת לב בגלל הנכס הייחודי שלהם. אנו מספקים פרוטוקול עבור קרטינוציטים אוראליים של עכבר פולחן במצב דמוי תאי גזע המתאים ליישומים במורד הזרם. התרבות של קרטינוציט אוראלי עכבר ואופייני שונה מקרטינוציט העור.
בפרוטוקול זה, בודדנו בהצלחה את קרטינוציט אוראלי העכבר הראשי ופיתחנו טכניקת תרבות ארוכת טווח. מערכת תרבות זו יכולה להיות מועסקת במבחנים מולקולריים וביוכימיים כדי להבין עוד יותר את התכונה של תאי גזע בזילרית אוראלי ומחלות הקשורות שלהם. לאחר הקרבת עכבר C57BLK6J מבוגר, להסיר את השיער סביב הפה עם מכונת גילוח ושימוש במספריים, לחתוך מן הלחיים לכיוון הלסת משני הצדדים.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הפה רחב ולספוג כל דם באמצעות צמר גפן, ולאחר מכן לחטא את הצבע על ידי ניגוב החלק הפנימי של הפה עם צמר גפן המכיל 10% יוד povidone. כדי לקצור את פלטת העכבר, תחילה באמצעות להב אזמל כירורגי, לבצע חתך שולי בעובי מלא לאורך צד לוח הצבעים של השיניים מקסילרי. לאחר מכן באמצעות פטל, בזהירות לנתח את כל לוח הצבעים.
העבר במהירות את רקמת הצבע לצינור 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של מדיום מלא בתוספת אנטיביוטיקה ותרופות אנטי ממיקוטיקה. שמור את הרקמות על קרח עד מוכן דגירה. במכסה המנוע של זרימה למינארית, העבר את הרקמות לצלחת 60 מ"מ המכילה ארבעה מיליליטר של מדיום מלא עם אנטיביוטיקה ותרופות אנטי ממיקוטיקה.
לאחר מכן באמצעות מלקחיים קהים קצרים להב אזמל, בעדינות להסיר כל דם מן הרקמות לשטוף את הרקמות 10 פעמים עם המדיום המלא. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את הרקמות לצלחת 35 מ"מ המכיל ארבעה מיליליטר של 0.025%טריפסין בתוספת אנטיביוטיקה ותרופות אנטי ממיקוטיקה. מניחים את הרקמות עם משטח האפיתל הפונה כלפי מטה ודגר אותם במשך 16 שעות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע התרבותי.
לאחר עיכול טריפסין בן לילה, השתמש בזוג אחד של מלקחיים קהים כדי להסיר את הרקמה מתמיסת טריפסין ולהעביר אותו לצלחת 60 מ"מ המכילה תמיסה מעכב טריפסין עם משטח האפיתל פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מחזיקים בקצה לוח הצבעים עם מלקחיים, משתמשים בלהב האזמל כדי לגרד בעדינות את שכבת האפיתל מהפרופריה הבסיסית של למינה. כדי לאסוף את הכמות המרבית של תאי אפיתל מן הרקמות, להעביר את הרקמה לתוך צלחת נוספת 60 מילימטר עם ארבעה מיליליטר של גירוד בינוני וחוזר על עצמו כפי שהוכח בעבר.
לאחר מכן, מניחים מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרון על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר. ובאמצעות פיפטה סטרילית, העבירו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין לתוך המסננת כדי להרטיב את פני השטח שלה. לאחר מכן באמצעות פיפטה, מערבבים את ההשעיה התאית בצלחת 60 מ"מ כמה פעמים ולסנן את התאים דרך מסננת התא 100 מיקרון.
כדי לספור את מספר התאים, להוסיף 15 microliters של השעיית התא ל 50 microliters של פתרון כחול טריפן, ולאחר מכן להעביר 10 microliters של תערובת כחול טריפן התא להמוציטומטר ולספור את מספר התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה השעיית התא, להסיר את supernatant ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום מלא המכיל Chelex FBS לצינור. resuspend גלולה התא על ידי titrating מספר פעמים באמצעות פיפטה חמישה מיליליטר.
לאחר מכן צלחת פעמיים עד חמש פעמים 10 עד התא החמישי מעכבר אחד לתוך באר אחת של צלחת 24-well מצופה מראש עם קולגן סוג אחד ודגורת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים מבלי לשנות את המדיום. קרטינוציטים אוראליים ראשוניים גדלו כמונו-שכבתית והציגו מורפולוגיה מרוצפת אבן. מושבות קרטינוציטים קטנות נראו לאחר שלושה וחמישה ימים.
לאחר שבוע של דגירה, המושבות הללו גדלו ויצרו מושבות הדוקות. הקטע הראשון בוצע שבועיים מהציפוי הראשוני ובמעברים מאוחרים יותר, הקרטינוציטים הציגו צמיחה יציבה עם תקופה קצרה יותר של תרבות. הקרטינוציטים הפסיקו לגדול אם התרחש זיהום פיברובלסט משמעותי במהלך תהליך הבידוד.
לאחר פולחן, הקרטינוציטים הביעו קרטין 14 ואלפא6-אינטאגרין. תאי מעבר מוקדמים ומאוחרים הראו ביטוי אחיד של P63 המאשר את גזענותם. עם זאת, קרטינוציטים שטופלו בסידן גבוה הציגו ירידה בביטוי P63 המציין כי טיפול בסידן גבוה מדכא גנים הקשורים לתאי גזע.
סמן הבידול קרטין 13 הראה ביטוי נדיר או ללא ביטוי בקטעים מוקדמים ומאוחרים, אך ביטוי משמעותי בטיפול בסידן גבוה. סמן פיברובלסט PDGFR אלפא לא בא לידי ביטוי בתרבות קרטינוציט המציין כי פרוטוקול זה יכול בהצלחה לבודד קרטינוציטים בזאלי ולשמור על תאים אלה במצב לא מובחנים. השמנה צריכה להתחיל מהצד האפידורלי ו 10 דקות לכל דגימת רקמה.
כמו כן, באופן כללי, pipetting של תאים חשוב עבור כדאיות התא. לאחר שניים או שלושה מעברים, קרטינוציט אוראלי הופך יציב לניסויים פונקציונליים נוספים. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם חיי עכבר מהונדסים עבור assay הסלולר והמולקולרי במבחנה.
מחקר שנערך לאחרונה דיווח על הדינמיקה וההטרוגניות של תאי גזע בזיליר אוראלי. שיטה זו תקל על חקר הביולוגיה של תאי הגזע האוראלית ותוביל להבנה טובה יותר של מחלות הפה.
