Récemment, les kératinocytes oraux ont attiré l’attention en raison de leur propriété unique. Nous fournissons un protocole pour la culture de kératinocytes oraux de souris dans un état semblable à celui des cellules souches, adapté aux applications en aval. La culture de kératinocyte oral de souris et caractéristique différente du kératinocyte de la peau.
Dans ce protocole, nous avons isolé avec succès le kératinocyte oral primaire de souris et développé une technique de culture à long terme. Ce système de culture peut être utilisé dans des essais moléculaires et biochimiques pour mieux comprendre les caractéristiques des cellules souches basilaires orales et leurs maladies connexes. Après avoir sacrifié une souris C57BLK6J adulte, enlevez les poils autour de la bouche avec un rasoir et à l’aide de ciseaux, coupez des joues vers la mâchoire des deux côtés.
Ensuite, utilisez des pinces pour ouvrir grand la bouche et absorber tout sang à l’aide d’un coton-tige, puis désinfectez la palette en essuyant l’intérieur de la bouche avec un coton-tige contenant 10% d’iode povidone. Pour récolter la palette de souris, commencez par utiliser une lame de scalpel chirurgical, faites une incision marginale de pleine épaisseur le long du côté de la palette des dents maxillaires. Ensuite, à l’aide d’un raspatorium, disséquez soigneusement toute la palette.
Transférer rapidement le tissu de la palette dans un tube de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu complet complété par des antibiotiques et des antimycotiques. Gardez les tissus sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’incubation. Dans une hotte à écoulement laminaire, transférer les tissus dans un plat de 60 millimètres contenant quatre millilitres de milieu complet avec des antibiotiques et des antimycotiques.
Ensuite, à l’aide de pinces contondantes courtes et d’une lame de scalpel, retirez doucement tout sang des tissus et lavez les mouchoirs 10 fois avec le milieu complet. Après le dernier lavage, transférer les tissus dans un plat de 35 millimètres contenant quatre millilitres de 0,025% de trypsine complétés par des antibiotiques et des antimycotiques. Placez les tissus avec la surface épithéliale vers le bas et incuubez-les pendant 16 heures à température ambiante dans la hotte de culture.
Après la digestion de la trypsine pendant la nuit, utilisez une paire de pinces contondantes pour retirer le tissu de la solution de trypsine et transférez-le dans un plat de 60 millimètres contenant une solution inhibitrice de la trypsine avec la surface épithéliale tournée vers le haut. Ensuite, en vous accrochant au bord de la palette avec une pince, utilisez la lame du scalpel pour gratter doucement la couche épithéliale de la lamina propria sous-jacente. Pour recueillir la quantité maximale de cellules épithéliales des tissus, transférez le tissu dans un autre plat de 60 millimètres avec quatre millilitres de milieu complet et répétez le grattage comme démontré précédemment.
Ensuite, placez une passoire cellulaire stérile de 100 microns sur un tube conique de 50 millilitres. Et à l’aide d’une pipette stérile, transférez deux millilitres de solution de trypsine dans la passoire pour mouiller sa surface. Ensuite, à l’aide d’une pipette, mélangez la suspension cellulaire dans la boîte de 60 millimètres plusieurs fois et filtrez les cellules à travers la passoire à cellules de 100 microns.
Pour compter le nombre de cellules, ajoutez 15 microlitres de la suspension cellulaire à 50 microlitres de solution de bleu de trypan, puis transférez 10 microlitres du mélange de bleu de trypan cellulaire à un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules. Ensuite, centrifugez la suspension de la cellule, retirez le surnageant et ajoutez deux millilitres de milieu complet contenant Chelex FBS au tube. Remettez en suspension la pastille de cellule en la titrant plusieurs fois à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.
Ensuite, plaquez deux à cinq fois 10 à la cinquième cellule d’une souris dans un puits de plaque de 24 puits pré-enduit de collagène de type un et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux jours sans changer le milieu. Les kératinocytes oraux primaires se sont développés en monocouche et présentaient une morphologie pavée. De petites colonies de kératinocytes étaient visibles après trois et cinq jours.
Après une semaine d’incubation, ces colonies se sont agrandies et ont formé des colonies serrées. Le premier passage a été effectué deux semaines après le placage initial et aux passages ultérieurs, les kératinocytes ont montré une croissance stable avec une période de culture plus courte. Les kératinocytes ont cessé de croître si une contamination importante par les fibroblastes se produisait pendant le processus d’isolement.
Après la culture, les kératinocytes ont exprimé la kératine 14 et l’alpha6-intégrine. Les cellules de passage précoce et tardif ont montré une expression uniforme de P63 confirmant leur souche. Cependant, les kératinocytes traités avec un taux élevé de calcium ont montré une diminution de l’expression de P63 indiquant que le traitement à haute teneur en calcium supprime les gènes liés aux cellules souches.
Le marqueur de différenciation kératine 13 a montré une expression rare ou nulle dans les passages précoces et tardifs, mais une expression significative dans le traitement à haute teneur en calcium. Le marqueur de fibroblastes PDGFR alpha n’a pas été exprimé dans la culture de kératinocytes, ce qui indique que ce protocole pourrait isoler avec succès les kératinocytes basaux et maintenir ces cellules à l’état indifférencié. Le piégeage doit commencer du côté épidural et 10 minutes par échantillon de tissu.
De plus, en général, le pipetage des cellules est important pour une meilleure viabilité cellulaire. Après deux ou trois passages, le kératinocyte oral devient stable pour d’autres expériences fonctionnelles. Il est important de noter que ce protocole peut être combiné avec la vie transgénique de la souris pour les tests cellulaires et moléculaires in vitro.
Des études récentes ont rapporté la dynamique et l’hétérogénéité des cellules souches basilaires orales. Cette méthode facilitera l’étude de la biologie des cellules souches buccales et permettra de mieux comprendre les maladies bucco-dentaires.
