הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

פרוטוקול זה מאפשר להתבונן ולזהות אירועי שעתוק ונותן תובנות על ההשפעות של הפסקות גדיל כפול DNA על שעתוק מתמשך של גן. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא תצפית של תמלילי RNA המסומנים בנפרד בתאים בודדים במרווחי זמן של שניות על פני תקופה כוללת של שעה אחת או יותר. שיטה זו מספקת תובנה על תגובת הנזק לדנ"א כדי לחקור את ההצלבה בין תמלול לתהליכים תאיים, כגון שכפול DNA ונגעים ב- DNA.

העצה שלנו היא להתבונן בתאים המשתמשים בדוקסיציקלין ולבצע מדידות כיול כדי לאמן את איתור אתר התמלול ומולקולות RNA המסומנות. בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, להכין פתרון A המכיל 150 microliters של DNA פלזמה MEM בסרום מופחת ו 2.5 מיקרוגרם לכל microliter של DNA ריאגנט עוזר transfection. במקביל, להכין פתרון B המכיל 150 microliters של MEM בסרום מופחת ו 1.5 מיקרוגרם לכל microliter של DNA ב ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם.

לדגור על שני הפתרונות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף בעדינות פתרון A לפתרון B ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להעביר את התאים, להוסיף 300 microliters של פתרון מעורב A ו- B טיפה לכל צלחת ולהפיץ אותו בעדינות. לאחסן את צלחת התחתונה זכוכית בתוך צלחת תרבית תאים סטנדרטית 100 מ"מ ודגור אותה ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה עם 5% פחמן דו חמצני.

הכן 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה צינור עם 200 microliters של DMEM עם HEPES ללא פנול אדום בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי פחם, ולאחר מכן להוסיף ת"א. כשעה לפני תחילת תצפית מיקרוסקופיה, לגרום תמלול של הגנים הכתב על ידי הוספת דוקסיציקלין למדיום הצמיחה בעדינות לערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה עם micropipette 200 microliter. להעביר את התאים למיקרוסקופ לפחות 30 דקות לפני תחילת התצפית ולהניח את צלחת 100 מ"מ עם התאים בתוך תא הדגירה מיקרוסקופ גדול מחומם מראש. מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה עם ת"א מדולל מראש בתוך התא הסביבתי המיקרוסקופ הגדול כדי לחמם אותו ל -37 מעלות צלזיוס.

החליפו את המכסה של צלחת הזכוכית התחתונה במכסה בעל חור קוטר של שלושה מילימטרים. בחר את המטרה טבילת שמן 100X בלוח הבקרה מיקרוסקופ ולהחיל טיפה של שמן טבילה למטרה. הגדר את צלחת התחתונה זכוכית עם התאים בתוך תא הדגירה שלב מיקרוסקופ ולנעול אותו במקום, ולאחר מכן לסגור את המכסה של אינקובטור הבמה ואת כל הדלתות של דיור מיקרוסקופ.

הפעל את תוכנת ההפעלה והשליטה של המיקרוסקופ, פתח את חלון בקרת המוקד ולחץ על חלונית הטווח. בחלונית בחירת הפליטה, לחץ על התיבה 100%עין כדי להגדיר את נתיב הקרן העין לתצפית ישירה מדגם באמצעות עין. בתפריט ערכת המסננים, עבור לסט מסנן עיניים ולחץ על ברייטפילד ולאחר מכן לחץ על לחצן ברייטפילד הפתוח.

הזז את מטרת המיקרוסקופ לכיוון צלחת התחתונה של הזכוכית עד שהשמן נוגע בכוס. הסתכל דרך המשקפת והתמקד באופן ידני במישור התאים, ולאחר מכן כבה את לחצן ברייטפילד הפתוח. השאירו את התאים למשך 30 דקות לפני תחילת התצפיות הניסיוניות כדי לאפשר להם להסתגל לתנאים הסביבתיים ולמנוע סחף מוקדי במהלך ההדמיה עקב שיפועי טמפרטורה.

הגדירו מיקרופיפט 200 מיקרוליטר ו-200 טיפים למיקרו-ליטר בטמפרטורת החדר. בחלון בקרת המיקוד של תוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את עוצמת הלייזר ל- 5% והזן ערך של 50 אלפיות השניה לזמן החשיפה. פתח את חלון הלכידה כדי להתאים את ההגדרות כדי לבצע רכישת תמונה אוטומטית של לוחות זמנים תלת-ממדיים.

בחר את סוג רכישת לכידת 3D והגדר 12 עד 16 פרוסות אופטיות המופרדות באמצעות 0.4 מיקרומטר. סמן את תיבות הסימון של הטווח סביב הזרם וחזור למיקום הנוכחי לאחר הלכידה. בחלונית לכידת הזמן, הזן ערך של 120 עבור מספר נקודות הזמן ו- 30 שניות עבור מרווח הזמן.

בחר את מסנן הקונפוקלי שנקבע על פי תוויות החלבון הפלואורסצנטיות המועברות כפי שצוין בכתב היד של הטקסט והגדר את זמן החשיפה עבור כל ערוץ ל- 50 אלפיות השנייה. השתמש בזרם ההגדרה עבור כוח הלייזר כדי להשתמש בערך של 5% שנבחר בחלון המוקד. בחלון פקד המוקד, עבור לחלונית המצלמה, בחר את פקד תצוגת התמונה קנה מידה ובחר בלחצן הידני כדי להגדיר טווח קבוע של עוצמות תמונה שיוצגו.

בחר את התאים להדמיית timelapse תלת-ממדית של אתרי שעתוק בעת אינדוקציה של שבירת גדיל כפול DNA. מסך התאים ובחר שלושה שדות תצוגה בהתאם לתנאים המתוארים בדיון בטקסט. התמקד בכל תא שנבחר שהיה ממוקם בעבר במרכז שדה הראייה עם אתר התמלול במישור האמצעי של מחסנית Z.

סמן כל מיקום XYZ במישור XY של חלון בקרת המוקד על-ידי לחיצה על נקודת ערכה. הוסף 200 מיקרוליטרים של ת"א מדולל מראש לתאים ולהתחיל את הדמיית סדרת הזמן 3D על ידי לחיצה על התחל בחלון הלכידה. שמור את נתוני ההדמיה בתבנית הנתונים של תוכנת בקרת המיקרוסקופ בכונן הקשיח של מחשב בקרת המיקרוסקופ.

הוסף 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין למדיום הצמיחה של התאים שעה אחת לפני תחילת רכישת התמונה מיקרוסקופית. הר את צלחת התחתונה זכוכית בתוך תא הדגירה שלב מיקרוסקופ ולהכין את רכישת התמונה כפי שהודגם בעבר. השתמש באותה עוצמת לייזר והגדרות חשיפה כמו קודם.

הגדר את הגדרות הלכידה לסדרת זמן 2D והגדר 120 נקודות זמן במרווחים של 500 אלפיות השניה בלוח לכידת הזמן. לרכוש עשרות סדרות זמן כיול ממיקומים מרובים על מנת ליצור ערכות נתונים לספור כמה מאות מדידות TFI תעתיק יחיד. באמצעות פרוטוקול זה, מתקבל גרף המציג את מספר תמלילי הגנים העיתונאיים המסומנים באופן פלואורסצנטי לאורך זמן עם רזולוציה זמנית של שניות על פני תקופות של עד שעות.

מהלך הזמן של ערכי TFI של אתר שעתוק גנים כתב PROM שכותרתו על ידי הצטברות של חלבון מעיל MS2 המסומן עם מולקולות חלבון פלואורסצנטי ירוק על תמלילים המתהווה מוצג כאן. האינדוקציה של DSB יחיד בגנים הכתבים מאפשרת לחקור את השפעתו על תמלול הגנים העיתונאי המתמשך וניטור אירועי שעתוק העולים מאתר DSB, כלומר תמלול שנגרם על ידי שבירה. ת"א חיבור ואינדוקציה של DSB מוביל לדיכוי של תמלול גנים כתב PROM לאחר כ 11 דקות כי הוא לא משוחזר עד 60 דקות.

השחזור המלא של אות PP7-RFP מראה אתחול תמלול שנגרם על-ידי שבירה. הגן כתב antisense EXON 2 מראה את סיום תמלול מונחה מקדם, אשר מוחלף לאחר מכן על ידי תעתיק פריצה נגד פרץ כפי שנחשף על ידי הצטברות של חלבון מעיל MS2 שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי אדום מחייב RNA שנוצר רצפי לולאת גזע MS2 antisense. בחירת התאים להדמיה, הגדר את הדמיית timelapse המטופל התאמת מיקום Z של אתר שעתוק שכותרתו בכל מיקום XY למרכז מחסנית Z שיש לרכוש.

ולבסוף, התוספת של ת"א מדולל במדיום הצמיחה חייבת להתבצע בזהירות רבה כדי למנוע כל משמרות של עמדות שנבחרו מראש עם תאים להיות בתמונה. הדמיה של תמלילי RNA יחיד בתלת-ממד לאורך זמן בתאים חיים יכולה להיות מיושמת כדי לחקור שעתוק RNA במהלך שכפול DNA או שינויים של שעתוק במהלך התקדמות מחזור התא.