Este protocolo permite observar e detectar eventos de transcrição e dá insights sobre os efeitos do DNA quebra duplamente na transcrição contínua de um gene. A principal vantagem da técnica é a observação de transcrições de RNA individualmente rotuladas em células únicas em intervalos de tempo de segundos durante um período total de uma hora ou mais. Este método fornece uma visão da resposta de danos de DNA para investigar o crosstalk entre transcrição e processos celulares, como replicação de DNA e lesões de DNA.
Nosso conselho é observar células usando doxiciclina e realizar medições de calibração para treinar a detecção do local de transcrição e moléculas de RNA rotuladas. Em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro, prepare a solução A contendo 150 microliters de DNA de plasma mem de soro reduzido e 2,5 microgramas por microlitra de DNA em reagente auxiliar de transfecção. Em paralelo, prepare a solução B contendo 150 microliters de mem soro reduzido e 1,5 microgramas por microliter de DNA em um reagente de transfecção à base de lipídio.
Incubar ambas as soluções à temperatura ambiente por cinco minutos e, em seguida, adicione suavemente a solução A à solução B e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Para transfectar as células, adicione 300 microliters de solução mista A e B dropwise a cada prato e distribua-a suavemente. Armazene a antena de fundo de vidro dentro de uma placa de cultura celular padrão de 100 milímetros e incuba-a a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono.
Prepare tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 200 microlitres de DMEM com HEPES sem vermelho fenol e complementado com soro bovino fetal 10% de carvão, em seguida, adicione TA. Aproximadamente uma hora antes de iniciar a observação da microscopia, induzir a transcrição dos genes repórteres adicionando doxiciclina ao meio de crescimento e misturar suavemente por pipetar para cima e para baixo com uma micropipette de 200 microliter. Transporte as células para o microscópio pelo menos 30 minutos antes de iniciar a observação e coloque a antena de 100 milímetros com as células dentro da câmara de incubação de microscópios de grande microscópio pré-aquecido. Coloque o tubo de microcentrifutura com o TA pré-diluído dentro da câmara ambiental de microscópio grande para aquecê-lo a 37 graus Celsius.
Substitua a tampa da tampa inferior do vidro por uma tampa que tenha um furo de três milímetros perfurado. Selecione o objetivo de imersão de óleo 100X no painel de controle do microscópio e aplique uma gota de óleo de imersão ao objetivo. Coloque o prato de fundo de vidro com as células dentro da câmara de incubação do estágio do microscópio e tranque-o no lugar, em seguida, feche a tampa da incubadora de palco e todas as portas da carcaça do microscópio.
Inicie o software de operação e controle do microscópio, abra a janela de controle de foco e clique no painel de escopo. No painel de seleção de emissões, clique na caixa 100% ocular para definir o caminho do feixe ocular para observação direta da amostra por olho. No menu do conjunto do filtro, mude para conjunto de filtro para olho e clique em Brightfield e pressione o botão Brightfield aberto.
Mova o objetivo do microscópio em direção ao prato de fundo de vidro até que o óleo toque o vidro. Olhe através dos oculares e concentre-se manualmente no plano das células, em seguida, desligue o botão Brightfield aberto. Deixe as células por 30 minutos antes de iniciar as observações experimentais para permitir que elas se adaptem às condições ambientais e evitem a deriva focal durante a imagem devido aos gradientes de temperatura.
Configure uma micropipette de 200 microliter e 200 dicas de filtro de microliter à temperatura ambiente. Na janela de controle de foco do software de controle de microscópio, defina a intensidade do laser para 5% e digite um valor de 50 milissegundos para o tempo de exposição. Abra a janela de captura para ajustar as configurações para realizar uma aquisição automatizada de imagens de caixas de tempo tridimensionais.
Selecione o tipo de aquisição de captura 3D e defina de 12 a 16 fatias ópticas separadas por 0,4 micrômetros. Marque as caixas de seleção em torno da corrente e retorne à posição atual após a captura. No painel de captura timelapse, digite um valor de 120 para o número de pontos de tempo e 30 segundos para o intervalo.
Selecione o conjunto de filtro confocal de acordo com os rótulos de proteína fluorescente transected, conforme mencionado no manuscrito do texto e, em cada canal, para 50 milissegundos. Use a corrente de ajuste para a potência do laser para usar o valor de 5% selecionado na janela de foco. Na janela de controle de foco, vá para o painel da câmera, selecione o controle de exibição de imagem em escala e escolha o botão manual para configurar uma faixa fixa de intensidades de imagem a serem exibidas.
Selecione as células para a imagem de timelapse 3D dos locais de transcrição após a indução de uma quebra de duplo fio de DNA. Trie as células e selecione três campos de visão de acordo com as condições descritas na discussão do texto. Concentre cada célula selecionada previamente localizada no centro do campo de visão com o local de transcrição no plano médio da pilha Z.
Marque cada posição XYZ no plano XY da janela de controle de foco clicando no set point. Adicione 200 microliters do TA pré-diluído às células e inicie a imagem da série 3D clicando no início da janela de captura. Salve os dados de imagem no formato de dados do software de controle de microscópio no disco rígido do computador de controle de microscópio.
Adicione 0,5 microgramas por mililitro de doxiciclina ao meio de crescimento das células uma hora antes de iniciar a aquisição de imagens de microscopia. Monte a placa de fundo de vidro dentro da câmara de incubação do estágio do microscópio e prepare a aquisição da imagem como demonstrado anteriormente. Use as mesmas configurações de intensidade e exposição do laser de antes.
Defina as configurações de captura para séries temporizais 2D e defina 120 pontos de tempo em intervalos de 500 milissegundos no painel de captura timelapse. Adquira dezenas de séries temporais de calibração de várias posições, a fim de gerar conjuntos de dados para contar várias centenas de medições de TFI de transcrição única. Usando este protocolo, um gráfico é obtido exibindo o número de transcrições genéticas de repórteres fluorescentes ao longo do tempo com uma resolução temporal de segundos durante períodos de até horas.
O curso temporal dos valores de TFI de um site de transcrição genética de repórteres PROM rotulado pelo acúmulo de proteína de casaco MS2 rotulada com as moléculas de proteína fluorescente verde em transcrições nascentes é mostrado aqui. A indução de um único DSB nos genes dos repórteres torna possível estudar seu impacto na transcrição genética do repórter em curso e no monitoramento de eventos de transcrição emergindo do site DSB, ou seja, transcrição induzida por invasões. A adição de TA e a indução de um DSB leva a uma supressão da transcrição genética do repórter PROM após cerca de 11 minutos que não é restaurada até 60 minutos.
A recuperação completa do sinal PP7-RFP mostra a iniciação da transcrição induzida por invasão. O gene do repórter antissense EXON 2 mostra a rescisão das transcrições orientadas pelo promotor, que é então substituída pela transcrição induzida por ruptura antissense, conforme revelado pelo acúmulo de proteína de casaco MS2 rotulada com uma proteína fluorescente vermelha vinculante ao RNA gerado a partir de sequências de loop de caule antisense MS2. Seleção das células para imagem, configure a imagem timelapse tratada ajustando a posição Z do local de transcrição etiquetada em cada posição XY no centro da pilha Z a ser adquirida.
E, finalmente, a adição do TA diluído no meio de crescimento deve ser executada com extremo cuidado para evitar que quaisquer mudanças das posições pré-selecionadas com células sejam imagens. A imagem de transcrições de RNA única em 3D ao longo do tempo em células vivas pode ser aplicada para estudar a transcrição do RNA durante a replicação do DNA ou alterações de transcrição durante a progressão do ciclo celular.
