Dieses Protokoll ermöglicht es, Transkriptionsereignisse zu beobachten und zu erkennen und gibt Einblicke in die Auswirkungen von DNA-Doppelstrangbrüchen auf die laufende Transkription eines Gens. Der Hauptvorteil der Technik ist die Beobachtung von einzeln markierten RNA-Transkripten in einzelnen Zellen in Zeitabständen von Sekunden über einen Gesamtzeitraum von einer Stunde oder mehr. Diese Methode bietet Einblicke in die Reaktion auf DNA-Schäden, um das Crosstalk zwischen Transkription und zellulären Prozessen wie DNA-Replikation und DNA-Läsionen zu untersuchen.
Unser Rat ist, Zellen mit Doxycyclin zu beobachten und Kalibrierungsmessungen durchzuführen, um den Nachweis der Transkriptionsstelle und der markierten RNA-Moleküle zu trainieren. In einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen Lösung A herstellen, die 150 Mikroliter reduzierte Serum-MEM-Plasma-DNA und 2,5 Mikrogramm pro Mikroliter DNA in Transfektionshilfsmittelreagenz enthält. Parallel dazu wird Lösung B mit 150 Mikrolitern reduziertem Serum-MEM und 1,5 Mikrogramm pro Mikroliter DNA in einem lipidbasierten Transfektionsreagenz hergestellt.
Beide Lösungen bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren, dann Lösung A vorsichtig zu Lösung B geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um die Zellen zu transfizieren, fügen Sie 300 Mikroliter Mischlösung A und B tropfenweise zu jeder Schale hinzu und verteilen Sie sie vorsichtig. Lagern Sie die Glasbodenschale in einer 100 Millimeter großen Standard-Zellkulturschale und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid.
Bereiten Sie 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern DMEM mit HEPES ohne Phenolrot und ergänzt mit 10% Holzkohle-gestreiftem fötalem Rinderserum vor und fügen Sie dann TA hinzu. Etwa eine Stunde vor Beginn der Mikroskopiebeobachtung induzieren Sie die Transkription der Reportergene, indem Sie Doxycyclin in das Wachstumsmedium geben und vorsichtig mischen, indem Sie mit einer 200 Mikroliter Mikropipette auf und ab pipettieren. Transportieren Sie die Zellen mindestens 30 Minuten vor Beginn der Beobachtung zum Mikroskop und legen Sie die 100-Millimeter-Schale mit den Zellen in die vorgewärmte große Mikroskop-Inkubationskammer. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem vorverdünnten TA in die große Mikroskop-Umgebungskammer, um es auf 37 Grad Celsius zu erwärmen.
Ersetzen Sie den Deckel der Glasbodenschale durch einen Deckel mit einem gebohrten Loch von drei Millimetern Durchmesser. Wählen Sie das 100-fache Ölimmersionsobjektiv im Mikroskopbedienfeld aus und tragen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Objektiv auf. Stellen Sie die Glasbodenschale mit den Zellen in die Inkubationskammer der Mikroskopstufe und verriegeln Sie sie, dann schließen Sie den Deckel des Bühneninkubators und alle Türen des Mikroskopgehäuses.
Starten Sie die Bedien- und Steuerungssoftware für das Mikroskop, öffnen Sie das Fokussteuerungsfenster und klicken Sie auf den Bereich. Klicken Sie im Emissionsauswahlbereich auf das 100%-Augenfeld, um den Augenstrahlpfad für die direkte Probenbeobachtung nach Auge festzulegen. Wechseln Sie im Filtersatzmenü zu Augenfiltersatz, klicken Sie auf Hellfeld, und drücken Sie dann die Schaltfläche Hellfeld öffnen.
Bewegen Sie das Mikroskopobjektiv in Richtung der Glasbodenschale, bis das Öl das Glas berührt. Schauen Sie durch die Augen und fokussieren Sie manuell auf die Ebene der Zellen, dann schalten Sie die geöffnete Brightfield-Taste aus. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten stehen, bevor Sie mit den experimentellen Beobachtungen beginnen, damit sie sich an die Umgebungsbedingungen anpassen und eine fokale Drift während der Bildgebung aufgrund von Temperaturgradienten verhindern können.
Stellen Sie eine 200 Mikroliter Mikropipette und 200 Mikroliter Filterspitzen bei Raumtemperatur auf. Stellen Sie im Fokuskontrollfenster der Mikroskopsteuerungssoftware die Laserintensität auf 5% ein und geben Sie einen Wert von 50 Millisekunden für die Belichtungszeit ein. Öffnen Sie das Aufnahmefenster, um die Einstellungen für eine automatisierte Bilderfassung von dreidimensionalen Zeitraffern anzupassen.
Wählen Sie den 3D-Erfassungstyp und legen Sie 12 bis 16 optische Scheiben fest, die durch 0,4 Mikrometer getrennt sind. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen des Bereichs um den Aktuellen und kehren Sie nach der Erfassung zur aktuellen Position zurück. Geben Sie im Zeitraffererfassungsbereich den Wert 120 für die Anzahl der Zeitpunkte und 30 Sekunden für das Intervall ein.
Wählen Sie das konfokale Filterset entsprechend den transezierten fluoreszierenden Proteinmarkierungen wie im Textmanuskript erwähnt aus und stellen Sie die Belichtungszeit für jeden Kanal auf 50 Millisekunden ein. Verwenden Sie den Einstellstrom für die Laserleistung, um den im Fokusfenster ausgewählten Wert von 5% zu verwenden. Wechseln Sie im Fokussteuerungsfenster zum Kamerabereich, wählen Sie das Steuerelement für die Bildanzeige skalieren aus, und wählen Sie die manuelle Schaltfläche aus, um einen festen Bereich der anzuzeigenden Bildintensitäten einzurichten.
Selektieren Sie die Zellen für die 3D-Zeitrafferbildgebung von Transkriptionsstellen bei Induktion eines DNA-Doppelstrangbruchs. Überprüfen Sie die Zellen, und wählen Sie drei Ansichtsfelder entsprechend den in der Erörterung des Textes beschriebenen Bedingungen aus. Fokussieren Sie jede ausgewählte Zelle, die sich zuvor in der Mitte des Sichtfeldes befand, mit der Transkriptionsstelle in der mittleren Ebene des Z-Stapels.
Markieren Sie jede XYZ-Position in der XY-Ebene des Fokussteuerungsfensters, indem Sie auf Sollwert klicken. Fügen Sie 200 Mikroliter des vorverdünnten TA zu den Zellen hinzu und starten Sie die 3D-Zeitreihenbildgebung, indem Sie im Erfassungsfenster auf Start klicken. Speichern Sie die Bilddaten im Datenformat der Mikroskopsteuerungssoftware auf der Festplatte des Mikroskopsteuerungscomputers.
0,5 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin eine Stunde vor Beginn der mikroskopischen Bildaufnahme in das Wachstumsmedium der Zellen geben. Montieren Sie die Glasbodenschale in der Inkubationskammer der Mikroskopstufe und bereiten Sie die Bildaufnahme wie zuvor demonstriert vor. Verwenden Sie die gleichen Laserintensitäts- und Belichtungseinstellungen wie zuvor.
Legen Sie die Erfassungseinstellungen für 2D-Zeitreihen und 120 Zeitpunkte in Intervallen von 500 Millisekunden im Zeitrafferbereich fest. Erfassen Sie Dutzende von Kalibrierungszeitreihen von mehreren Positionen, um Datensätze zu generieren, die mehrere hundert TFI-Messungen mit einem einzigen Transkript zählen. Mit diesem Protokoll wird ein Graph erhalten, der die Anzahl der fluoreszenzmarkierten Reporter-Gentranskripte im Laufe der Zeit mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden über Zeiträume von bis zu Stunden anzeigt.
Der zeitliche Verlauf der TFI-Werte einer PROM-Reporter-Gentranskriptionsstelle, die durch die Akkumulation von MS2-Mantelprotein markiert ist, das mit den grün fluoreszierenden Proteinmolekülen auf entstehenden Transkripten markiert ist, ist hier dargestellt. Die Induktion eines einzelnen DSB in den Reportergenen ermöglicht es, seinen Einfluss auf die laufende Reporter-Gentranskription und die Überwachung von Transkriptionsereignissen, die von der DSB-Stelle ausgehen, nämlich der breakinduzierten Transkription, zu untersuchen. Ta-Addition und Induktion eines DSB führt nach etwa 11 Minuten zu einer Unterdrückung der PROM-Reporter-Gentranskription, die erst nach 60 Minuten wiederhergestellt wird.
Die vollständige Wiederherstellung des PP7-RFP-Signals zeigt eine bruchinduzierte Transkriptionsinitiation. Das EXON 2-Antisense-Reporter-Gen zeigt die promotorgesteuerte Transkriptionsterminierung, die dann durch eine Antisense-Break-induzierte Transkription ersetzt wird, wie die Akkumulation von MS2-Mantelprotein zeigt, das mit einem rot fluoreszierenden Protein markiert ist, das an RNA bindet, die aus Antisense-MS2-Stammschleifensequenzen erzeugt wurde. Auswahl der Zellen für die Bildgebung, Einrichtung der behandelten Zeitrafferbildgebung Anpassung der Z-Position der markierten Transkriptionsstelle an jeder XY-Position in die Mitte des zu erfassenden Z-Stacks.
Und schließlich muss die Zugabe des im Wachstumsmedium verdünnten TA mit äußerster Sorgfalt durchgeführt werden, um Verschiebungen der vorausgewählten Positionen mit den abzubildenden Zellen zu verhindern. Die Bildgebung einzelner RNA-Transkripte in 3D im Laufe der Zeit in lebenden Zellen kann angewendet werden, um die RNA-Transkription während der DNA-Replikation oder Änderungen der Transkription während der Zellzyklusprogression zu untersuchen.
