이 프로토콜은 전사 사건을 관찰하고 검출할 수 있게 하고 유전자의 지속적인 전사에 DNA 이중 가닥 휴식의 효력에 관하여 통찰력을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 총 1시간 이상의 시간 동안 초당 간격으로 단일 세포에서 개별적으로 표지된 RNA 전사체의 관찰이다. 이 방법은 DNA 복제 및 DNA 병변과 같은 전사와 세포 과정 사이의 교차토크를 조사하기 위해 DNA 손상 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.
우리의 조언은 독시사이클린을 사용하여 세포를 관찰하고 전사 부위와 표지 된 RNA 분자의 검출을 훈련하기 위해 교정 측정을 수행하는 것입니다. 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에서, 경질 도우미 시약에서 감소된 혈청 MEM 혈장 DNA 150마이크로리터와 DNA 의 마이크로리터 당 2.5 마이크로그램을 포함하는 솔루션 A를 준비한다. 동시에, 지질 계 형질 전환 시약에서 DNA의 마이크로리터 당 150 마이크로 리터및 1.5 마이크로 그램을 포함하는 용액 B를 준비합니다.
실온에서 솔루션을 5분 간 배양한 다음 솔루션 A를 솔루션 B에 부드럽게 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 세포를 변형시키기 위해, 혼합 용액 A와 B의 300 마이크로 리터를 각 접시에 드롭 와이즈를 추가하고 부드럽게 분배합니다. 유리 바닥 접시를 100mm 표준 세포 배양 접시 안에 보관하고 5 %의 이산화탄소로 가습 된 분위기에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.
페놀 레드 없이 HEPES로 200 마이크로리터를 장착하고 10%의 숯을 벗겨진 태아 소 세럼으로 보완한 다음 TA를 추가하여 1.5 밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브를 준비합니다. 현미경 관찰을 시작하기 약 1 시간 전에, 성장 배지에 독시 사이클린을 추가하여 기자 유전자의 전사를 유도하고 부드럽게 200 마이크로 리터 마이크로 파이프로 위아래로 파이펫하여 혼합. 관찰을 시작하기 전에 적어도 30 분 현미경으로 세포를 수송하고 예열 된 큰 현미경 인큐베이션 챔버 내부의 세포와 함께 100 밀리미터 접시를 놓습니다. 마이크로센트심분리기 튜브를 대형 현미경 환경 챔버 내부에 미리 희석된 TA로 배치하여 섭씨 37도까지 데우십시오.
유리 바닥 접시의 뚜껑을 드릴링 된 3 밀리미터 직경 구멍이있는 뚜껑으로 교체하십시오. 현미경 제어판에서 100X 오일 침지 목표를 선택하고 목표에 침지 오일 한 방울을 적용합니다. 현미경 단계 인큐베이션 챔버 내부의 세포와 유리 바닥 접시를 설정하고 장소에 잠근 다음 단계 인큐베이터의 뚜껑과 현미경 하우징의 모든 문을 닫습니다.
현미경 작동 및 제어 소프트웨어를 시작하고 포커스 제어 창을 열고 범위 창을 클릭합니다. 배출 선택 창에서 100% 눈 상자를 클릭하여 눈별 직접 시료 관찰을 위한 안구 빔 경로를 설정합니다. 필터 세트 메뉴에서 아이 필터 세트로 전환하고 브라이트필드를 클릭한 다음 열린 브라이트필드 버튼을 누릅니다.
오일이 유리에 닿을 때까지 현미경 목표를 유리 바닥 접시쪽으로 이동합니다. 안구를 살펴보고 셀의 평면에 수동으로 초점을 맞춘 다음 열린 브라이트필드 버튼을 끕니다. 실험 관측을 시작하기 전에 세포를 30분 동안 방치하여 환경 조건에 적응하고 온도 그라데이션으로 인해 이미징 중에 초점 드리프트를 방지할 수 있습니다.
실온에 200 마이크로리터 마이크로파이프와 200 마이크로리터 필터 팁을 설정합니다. 현미경 제어 소프트웨어의 초점 제어 창에서 레이저 강도를 5%로 설정하고 노출 시간 동안 50밀리초의 값을 입력합니다. 캡처 창을 열어 설정을 조정하여 3차원 시간 경과를 자동화된 이미지 수집을 수행합니다.
3D 캡처 획득 유형을 선택하고 0.4 마이크로미터로 분리된 12~16개의 광학 슬라이스를 설정합니다. 현재 범위의 확인란을 선택하여 캡처 후 현재 위치로 돌아갑니다. 타임랩스 캡처 창에서 시간 포인트 수에 대해 120의 값을 입력하고 간격의 경우 30초를 입력합니다.
텍스트 원고에 언급된 대류 형광 단백질 라벨에 따라 설정된 공초점 필터세트를 선택하고 각 채널의 노출 시간을 50밀리초로 설정합니다. 레이저 전원에 대한 설정 전류를 사용하여 포커스 창에서 선택한 5%의 값을 사용합니다. 초점 제어 창에서 카메라 창으로 이동하여 스케일 이미지 표시 컨트롤을 선택하고 수동 버튼을 선택하여 표시할 이미지 강도의 고정 범위를 설정합니다.
DNA 이중 가닥 브레이크를 유도할 때 전사 부위의 3D 타임랩스 이미징을 위한 세포를 선택합니다. 셀을 선별하고 텍스트 토론에 설명된 조건에 따라 세 가지 보기 필드를 선택합니다. 이전에 관측 필드의 중심에 있는 각 셀에 Z 스택의 중간 평면에 전사 부위를 포커스를 지정합니다.
설정 점을 클릭하여 포커스 컨트롤 창의 XY 평면에 각 XYZ 위치를 표시합니다. 미리 희석된 TA의 200마이크로리터를 세포에 추가하고 캡처 창에서 시작을 클릭하여 3D 타임시리즈 이미징을 시작합니다. 현미경 제어 컴퓨터 하드 드라이브에 현미경 제어 소프트웨어 데이터 형식에 이미징 데이터를 저장합니다.
현미경 이미지 수집을 시작하기 전에 세포의 성장 배지에 독시 사이클린의 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램을 추가합니다. 현미경 단계 인큐베이션 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 마운트하고 이전에 설명한 대로 이미지 수집을 준비한다. 이전과 동일한 레이저 강도 및 노출 설정을 사용합니다.
2D 타임 시리즈의 캡처 설정을 설정하고 타임랩스 캡처 패널에서 500밀리초 간격으로 120시간 포인트를 설정합니다. 수백 개의 단일 전사체 TFI 측정을 계산하기 위해 데이터 집합을 생성하기 위해 여러 위치에서 수십 개의 교정 타임 시리즈를 획득합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 그래프는 최대 시간의 기간에 걸쳐 초의 시간적 해상도와 시간이 지남에 따라 형광 표지 기자 유전자 성적 증명서의 수를 표시하는 얻어진다.
초기 성적증명서에 녹색 형광 단백질 분자로 표지된 MS2 코트 단백질의 축적에 의해 표지된 PROM 기자 유전자 전사 부위의 TFI 값의 시간 과정이 여기에 나와 있다. 기자 유전자에 있는 단일 DSB의 유도는 DSB 사이트에서 나오는 전사 사건의 지속적인 기자 유전자 전사 및 감시에 그것의 충격을 연구하는 가능하게 합니다, 즉 브레이크 유도 전사. DSB의 TA 첨가 및 유도는 60분까지 회복되지 않는 약 11분 후에 PROM 기자 유전자 전사의 억제로 이어집니다.
PP7-RFP 신호의 완전한 복구는 고장 유발 전사 개시를 나타낸다. EXON 2 안티센스 리포터 유전자는 프로모터 구동 전사 종료를 나타내며, 이는 안티센스 MS2 줄기 루프 서열에서 생성된 RNA에 결합하는 적색 형광 단백질로 표지된 MS2 코트 단백질의 축적에 의해 밝혀진 바와 같이 안티센스 브레이크 유도 전사로 대체된다. 이미징을 위한 세포의 선택은, 각 XY 위치에 표지된 전사 부위의 Z 위치를 조정하는 처리된 타임랩스 이미징을 Z 스택의 중심으로 설정하여 획득한다.
그리고 마지막으로, 성장 배지에서 희석된 TA의 첨가는 미리 선택된 위치의 임의의 이동을 방지하기 위해 극도의 주의를 기울여 실행되어야 하며, 이는 전산된 위치와 함께 이미지화되어야 한다. 살아있는 세포에서 시간이 지남에 따라 3D에서 단일 RNA 전사체의 이미징은 세포 주기 진행 중 DNA 복제 또는 전사의 변화 동안 RNA 전사를 연구하기 위해 적용될 수 있다.
