يسمح هذا البروتوكول باستخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد بطريقة تحافظ على بنيتها وتحد من كمية جزيئات الجليكوجين الصغيرة المفقودة. مع الأبحاث السابقة التي تظهر أن مرض السكري يغير بنية الجليكوجين ، يمكن أن توفر هذه الطريقة في دراسة مرض السكري ومرض تخزين الجليكوجين المختلف. لاستخراج الجليكوجين من الكبد ، ابدأ بنقل جرام واحد من أنسجة الكبد المجمدة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على ستة ملليلتر من محلول عزل الجليكوجين.
مع الحفاظ على الجليد ، قم بتجانس أنسجة الكبد باستخدام خالط الأنسجة. عند الانتهاء ، انقل نصف أو ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب جديد ، يليه الغليان لمدة 10 دقائق. احتفظ بالنصف الآخر من المعلق على الجليد لاستخراج البروتينات المرتبطة المحتوية على الجليكوجين والتي لم يتم تغيير طبيعتها.
لتحديد محتوى الجليكوجين ، قم بإزالة قسامة ثمانية ميكرولتر من كل أنبوب واحتفظ بالأنبوب على الجليد. بعد تدوير المعلق المتبقي عند 6،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة لطردها مركزيا عند 3.6 مرات 10 إلى G الخامسة وأربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد التخلص من المواد الطافية المتبقية ، أعد تعليق الكريات في 1.5 ملليلتر من محلول عزل الجليكوجين.
بعد ذلك ، ضع العينات فوق 1.5 ملليلتر من محلول السكروز 30٪ في أربعة أنابيب طرد مركزي فائقة ملليلتر ، متبوعة بالطرد المركزي كما هو موضح من قبل لمدة ساعتين. بعد التخلص من المواد الطافية ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. لترسيب الجليكوجين من تعليق الخلية ، أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى معلقات الخلية واخلطها جيدا.
بعد ذلك ، قم بتخزين المخاليط في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح بهطول الأمطار. بمجرد حدوث هطول الأمطار ، قم بطرد العينات عند 6،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وأعد تعليق حبيبات الجليكوجين في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات لتكرار عملية ترسيب الإيثانول ثلاث مرات. من تعليق الخلية النهائي ، قم بإزالة حصة من ثمانية ميكرولتر من كل أنبوب لتحديد محتوى الجليكوجين.
ثم قم بتجميد المواد الطافية المتبقية في النيتروجين السائل وقم بتجميدها جافة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتخزين عينات الجليكوجين المجففة في الفريزر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. حللت الدراسة النقاء والعائد الخام وإنتاج الجليكوجين لعينة الجليكوجين المجففة المستخرجة من ظروف مختلفة.
لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في المحصول الخام وإنتاج الجليكوجين بين المجموعات المستخرجة مع الظروف المختلفة. في المقابل ، تأثرت نقاء الجليكوجين بشكل كبير بتركيزات السكروز وإضافة خطوة الغليان. تم استخراج الجليكوجين بأعلى درجة نقاء باستخدام تركيز السكروز 30٪ وخطوة الغليان لمدة 10 دقائق.
تم استخراج الجليكوجين من تجانس الكبد إما بنسبة 30٪ 50٪ أو 72.5٪ سكروز ، مسلوق أو غير مسلوق ، لتقييم آثار الظروف المختلفة على حجم الجزيئات في المستخلص النهائي. تم إجراء تحليل طول السلسلة على ستة أكباد لكل من المغلي وغير المغلي ، باستخدام تركيزات 30٪ 50٪ و 72.5٪ سكروز. تم حساب محتوى جزيئات الجليكوجين أو جزيئات بيتا ذات نصف قطر هيدروديناميكي ، RH ، أقل من 30 نانومتر.
كان للعينات المغلية متوسط قيم RH أقل ومحتوى جسيمات أعلى من العينات غير المغلية. أيضا ، أدى انخفاض تركيزات السكروز إلى انخفاض قيم RH ومحتويات أعلى من جسيمات بيتا. أدى إدخال خطوة الغليان أيضا إلى انخفاض الحد الأقصى للرطوبة النسبية أو القيم القصوى ، في حين أن تركيز السكروز لم يكن له تأثير كبير.
تأكد من أن الأنسجة متجانسة تماما ولا توجد قطع من الأنسجة المتبقية. لذلك ، تمهد هذه التقنية الطريق لنا لاستكشاف المسارات التي تربط جسيمات بيتا الأصغر معا لتشكيل جسيمات ألفا الأكبر.
