الفحص القائم على المجهر لدراسة وتحليل الاندوسومات المعاد تدويرها باستخدام الاتجار بالسونار. هذه هي الخلايا الصباغية الجلد. تسمى العضيات ذات اللون الأسود التي تراها داخل الخلايا الميلانوسومات.
ومن المعروف الميلانوسومات كفئة من العضيات تسمى العضيات المرتبطة lysozome أو LRO. إعادة تدوير الاندوسومات هي العضيات المركبات أنبوبي من الاندوسومات في وقت مبكر أو الفرز في جميع أنواع الخلايا. هذه العضيات تلعب دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات، وهو العضيات المرتبطة lysozome التي تنتجها الخلايا الصباغية.
إعادة تدوير الاندوسومات تسليم البضائع الخاصة بالخلايا الصباغية إلى الميلانوسومات المبكرة أثناء تشكيلها. جيل إعادة تدوير الاندوسومات التي لوحظت في العديد من المتلازمة هو خلايا في فرط تصبغ الجلد والشعر والعين. لذلك ، فإن دراسة ديناميكيات إعادة تدوير الاندوسومات مفيدة لفهم وظيفة هذه العضيات في الظروف الطبيعية والمرضية.
تهدف هذه الدراسة إلى قياس ديناميكيات إندوسومز إعادة التدوير باستخدام اعتقال بناء الجملة SNARE-13. الخطوة الأولى هي بذر الخلايا الصباغية الماوس على coverlips المعالجة مسبقا. معطف يغطي الزجاج في طبق بيتري في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط.
وجففه في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. غسل الأغطية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X قبل الاستخدام. البذور الخلايا على غشاء الطابق السفلي يغطي المغلفة المتوسطة في كفاءة 50 إلى 60٪.
أضف دائما 200 نانومولار من PMA إلى تعليق الخلية المطلية في وسائط RPMI كاملة. بعد بذر الخلايا، احتضان الطبق الذي يحتوي على خلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 24 ساعة. الخطوة الثانية هي نقل الخلايا مع syntaxin-13 البلازميدات.
احتضان النصائح التي تحتوي على الحمض النووي وكشف العدوى، مزيج لمدة خمس دقائق وتخلط دون pipetting المتكررة. اضغط على الأنبوب باليد كل عشر دقائق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1X، مرة واحدة باستخدام OPTI-MEM، ثم أضف 1 ميل من OPTI-MEM إلى الخلايا.
بعد 30 دقيقة من الحضانة ، أضف مزيج الحمض النووي الكاشف للإصابة إلى الخلايا بطريقة قطرة حكيمة من خلال تغطية الطبق. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. يستنشق المتوسطة OPTI-MEM مع كاشف العدوى وإضافة المتوسطة RPMI كاملة تكملها مع 200 nanomolars من PMA.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. الخطوة الثالثة هي تثبيت الخلايا. يرجى ملاحظة أنه يتم تنفيذ الإجراء التالي خارج غطاء محرك الأنسجة.
بعد 48 ساعة من العدوى، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1X ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 3٪ من الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1X وخزن الأغطية في برنامج تلفزيوني 1X حتى مزيد من الاستخدام. بدلا من ذلك، يمكن تركيب الخلايا على ألواح زجاجية أو تخزينها في أربع درجات مئوية.
الخطوة الرابعة هي التأني المناعي للخلايا. إعداد غرفة رطبة. وضع قطع قطعة parafilm على ورقة تصفية الماوس في طبق بيتري.
تغطية مع رقائق الألومنيوم. إعداد 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية. إضافة الأجسام المضادة في تخفيف من 1 إلى 200.
إضافة هذا الحل كقطر على البارافيلم في غرفة رطبة. رفع بعناية coverlip مع ملقط. عكس ذلك على قطرة من الأجسام المضادة الأولية تلطيخ الحل، ومن ثم تغطية غطاء الغرفة الرطبة.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وبالمثل، إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في تخفيف من 1 إلى 500 ووضعه على parafilm بجوار غطاء في غرفة رطبة. لتلطيخ النواة، أضف DAPI في تخفيف من 120، 000 إلى 130، 000 إلى الحل.
باستخدام ملقط، والتقاط بعناية coverslip من الحل الأساسي للأجسام المضادة وتراجع مرتين في برنامج تلفزيوني 1X. اضغط على غطاء على ورق الأنسجة لإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة على coverlip. وضعه على حل تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية في غرفة رطبة ولا يعرضها للضوء، وذلك بسبب وجود الأجسام المضادة مصبوغة الفلورسنت في الحل.
بعد الحضانة ، التقط بعناية الغطاء من محلول الأجسام المضادة الثانوي ثم تراجعه مرتين في برنامج تلفزيوني 1X. علاوة على ذلك، اضغط على غطاء الغطاء على ورق الأنسجة لإزالة برنامج تلفزيوني الزائد على غطاء. ضع 12 ميكرولتر من كاشف التصوير على شريحة زجاجية وضع بعناية غطاء ملون على كاشف التركيب.
عكس الشريحة الزجاجية على ورق الأنسجة ثم اضغط بلطف. بعد ذلك ، قم بتصوير الغطاء باستخدام مجهر مضان وتحليل الصور باستخدام ImageJ. الخطوة السادسة هي تحديد التداخل بين إعادة تدوير البروتينات المحلية والميلانوسومات.
القياس الكمي لبناء الجملة-13 دلتا-129 كولوكاليشن مع الميلانوسومات. أظهر المجهر المناعي لبناء الجملة-13 في الخلايا الصباغية من النوع البري للفأر GFP-syntaxin-13 البرية من النوع المترجم كهياكل المركبات والأنابيب. وGFP-syntaxin-13 دلتا-129 يترجمة الهياكل مثل حلقة بالإضافة إلى سطح الخلية.
علاوة على ذلك ، أظهرت حلقة داخل الخلية مثل GFP-syntaxin-13 delta-129 كولوكاليزم مع بروتين الميلانوسوم TYRP1 في الميلانوسومات المشرقة على شكل حقل. كما هو مبين من قبل، لوحظ مجموعة من نوع البرية GFP-syntaxin-13 مفرط التعبير في الميلانوسومات. لقياس التعريب النسبي للGFP-syntaxin-13 نوع البرية وGFP-syntaxin-13 دلتا-129 إلى الميلانوسومات، تم استخدام البرمجيات فيجي وتم تحليل مع البرنامج المساعد JACOP.
معامل التداخل المقاس Mander، أي MOC، بين GFP-syntaxin-13 دلتا-129 مع TYRP1 هو تقريبا 1.5 أضعاف أعلى بالمقارنة مع نوع البرية GFP-syntaxin-13 مع TYRP1. ومن المثير للاهتمام، أظهرت TYRP1 2.9 أضعاف قيم MOC أعلى مع GFP-syntaxin-13 دلتا-129 مقارنة مع نوع البرية GFP-syntaxin-13. تشير هذه البيانات إلى أن توطين GFP-syntaxin-13 delta-129 melanosomes أعلى نسبيا مقارنة بنوع GFP-syntaxin-13 البري في حالة ثابتة.
تحديد كمي لتعريب نوع بناء الجملة-13 البرية من الاندوسومات إعادة التدوير. أظهر المجهر المناعي من نوع GFP-syntaxin-13 البرية كولوكالينج مع البروتين الإندووسومي المعروف إعادة التدوير Rab11. و MOC بين GFP-syntaxin-13 نوع البرية مع mCherry-Rab11 هو ما يقرب من 1.4 أضعاف أعلى بالمقارنة مع mCherry-Rab11 مع GFP-syntaxin-13 نوع البرية.
ولقياس عدد وطول الأنابيب الاندومالية الإيجابية من النوع البري GFP-syntaxin-13، استخدمت برمجيات فيجي على النحو المبين في قسم البروتوكول. يستخدم mCherry-Rab11 عنصر تحكم إيجابي في التجارب. وأظهرت الخلايا الصباغية التي تم تحويلها مع نوع البرية GFP-syntaxin-13 عددا أكبر من الأنابيب لكل خلية مقارنة مع الخلايا التي تعبر عن mCherry-Rab11.
ومع ذلك، يتم تقليل الأنابيب عند التعبير المشترك لكل من نوع GFP-syntaxin-13 البرية و mCherry-Rab11 في الخلايا. الخطوة السابعة هي تحديد كمي لإعادة تدوير عدد الاندوسومات الأنبوبية وطولها. يتم تقليل الأنابيب عند التعبير المشترك لكل من نوع GFP-syntaxin-13 البري و mCherry-Rab11 في الخلايا.
ومن المثير للاهتمام، متوسط طول أنبوبي من كل من نوع البرية GFP-syntaxin-13 و mCherry-Rab11 مماثلة لبعضها البعض في الخلايا التي تعبر بشكل فردي أو معا. معا، تشير هذه البيانات إلى أن نوع GFP-syntaxin-13 البرية يترجمة لإعادة تدوير الاندوسومات على غرار Rab11. وأظهرت هذه الدراسة أن تسليم N-المحطة الطرفية من syntaxin-13 متحولة، وهذا هو GFP-syntaxin-13 دلتا-129، يحط إلى الميلانوسومات GFP-syntaxin-13 دلتا-129 يمكن أن تستخدم ربما كمراسل للاتجار المركبات من إعادة تدوير الاندوسومات إلى سطح الخلية وLRO.
في المقابل، نوع البرية GFP-syntaxin-13 ي محلية لإعادة تدوير الاندوسومات مماثلة ل Rab11. أوضحت هذه الدراسة أنه يمكن أيضا استخدام نوع GFP-syntaxin-13 البري لوضع علامات على إعادة تدوير الاندوسومات في الخلايا الصباغية. قد يكون نوع GFP-syntaxin-13 البري علامة endosomal إعادة تدوير أفضل من Rab11 ، نظرا لأن Rab11 يغير ديناميكيات الاندوسومال.
كل ذلك معا، GFP-syntaxin-13 نوع البرية يعمل علامة إعادة التدوير endosomal المحتملة لدراسة ديناميات في ظروف الحالة الثابتة.
