Il test basato sulla microscopia per studiare e analizzare gli endosomi di riciclaggio utilizzando il traffico SNARE. Questi sono melanociti della pelle. Gli organelli di colore nero che si vedono all'interno delle cellule sono chiamati melanosomi.
I melanosomi sono noti come una classe di organelli chiamati organelli correlati al lisozoma o LRO. Gli endosomi di riciclaggio sono organelli vescicolari tubolari da endosomi precoci o di smistamento in tutti i tipi di cellule. Questi organelli svolgono un ruolo chiave nella biogenesi dei melanosomi, un organello correlato al lisozoma prodotto dai melanociti.
Gli endosomi riciclati trasportano il carico specifico dei melanociti ai melanosomi prematuri durante la loro formazione. la generazione di endosomi riciclati osservata in diverse sindromi è cellule in iperpigmentazione di pelle, capelli e occhi. Pertanto, studiare le dinamiche del riciclaggio degli endosomi è utile per comprendere la funzione di questi organelli in condizioni normali e di malattia.
Questo studio mira a misurare le dinamiche degli endosomi di riciclaggio utilizzando la sintassi SNARE di arresto in-13. Il primo passo è la semina di melanociti di topo su coverslip pre-trattati. Rivestire le coperture in vetro nella capsula di Petri in mezzo a matrice di membrana basale.
E asciugarlo nella cappa di coltura del tessuto per 15 minuti. Lavare le coverslip una volta con 1X PBS prima dell'uso. Semina le cellule sulla membrana basale con coperture a rivestimento medio con una competenza compresa tra il 50 e il 60%.
Aggiungere sempre 200 nanomolari di PMA alla sospensione a celle placcate in supporti RPMI completi. Dopo aver seminato le cellule, incubare il piatto contenente cellule nell'incubatore a CO2 per 12-24 ore. Il secondo passo è la trasfezione di cellule con plasmidi sintassina-13.
Incubare le punte contenenti DNA e reagente di trasfezione, mescolare per cinque minuti e mescolare senza pipettaggio ripetuto. Toccare il tubo con la mano ogni dieci minuti per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, lavare le cellule due volte con 1X PBS, una volta con OPTI-MEM, quindi aggiungere 1 mil di OPTI-MEM alle cellule.
Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere la miscela di DNA del reagente di trasfezione alle cellule in modo a goccia coprendo il piatto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per sei ore. Aspirare il mezzo OPTI-MEM con reagente di trasfezione e aggiungere un mezzo RPMI completo integrato con 200 nanomolari di PMA.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore. Il terzo passo è la fissazione delle cellule. Si prega di notare che la seguente procedura viene eseguita al di fuori del cappuccio di coltura del tessuto.
Dopo 48 ore di trasfezione, lavare le cellule due volte con 1X PBS e quindi fissare le cellule con il 3% di formaldeide per 30 minuti. Dopo la fissazione, lavare le celle due volte con 1X PBS e conservare le coverslip in 1X PBS fino a nuovo utilizzo. In alternativa, le celle possono essere montate su lastre di vetro o conservate a quattro gradi Celsius.
Il quarto passo è l'immunocolorazione delle cellule. Preparare una camera umida. Posizionare il pezzo tagliato parafilm su una carta da filtro per mouse in una capsula di Petri.
Coprire con foglio di alluminio. Preparare 25 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Aggiungere anticorpi a una diluizione da uno a 200.
Aggiungere questa soluzione come goccia sul parafilm nella camera umida. Sollevare con attenzione il coperchio con una pinza. Invertirlo sulla goccia della soluzione di colorazione degli anticorpi primari e quindi coprire il coperchio della camera umida.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Allo stesso modo, preparare la soluzione anticorpale secondaria a una diluizione da uno a 500 e posizionarla sul parafilm accanto al coverslip nella camera umida. Per colorare il nucleo, aggiungere DAPI a una diluizione da 120.000 a 130.000 alla soluzione.
Usando la pinza, prelevare con attenzione il coverslip dalla soluzione anticorpale primaria e immergerlo due volte in 1X PBS. Toccare il coperchio su carta velina per rimuovere il PBS in eccesso sul coperchio. Posizionarlo sulla soluzione di colorazione anticorpale secondaria nella camera umida e non esporlo alla luce, a causa della presenza di anticorpi colorati fluorescenti nella soluzione.
Dopo l'incubazione, prelevare con attenzione il coverslip dalla soluzione anticorpale secondaria e quindi immergerlo due volte in 1X PBS. Inoltre, toccare il coperchio su carta velina per rimuovere il PBS in eccesso sul coperchio. Posizionare 12 microlitri di reagente di imaging su un vetrino e posizionare con attenzione il coperchio colorato sul reagente di montaggio.
Capovolgere il vetrino sulla carta velina e quindi premere delicatamente. Quindi, immagina il coverslip usando un microscopio a fluorescenza e analizza le immagini usando ImageJ. Il sesto passo è la quantificazione della sovrapposizione tra le proteine localizzate dell'endosoma di riciclaggio e i melanosomi.
Quantificazione della sintassiina-13 delta-129 colocalizzazione con i melanosomi. La microscopia a immunofluorescenza della sintassiina-13 nei melanociti wild type di topo ha mostrato GFP-syntaxin-13 wild-type localizzato come strutture vescicolari e tubolari. E GFP-syntaxin-13 delta-129 localizza strutture simili ad anelli oltre alla superficie cellulare.
Inoltre, la GFP-syntaxin-129 delta-129 ad anello intracellulare ha mostrato colocalizzazione con la proteina melanosoma TYRP1 in melanosomi luminosi con immagini di campo. Come mostrato in precedenza, una coorte di GFP-syntaxin-13 wild type sovraespressa è osservata nei melanosomi. Per misurare la localizzazione relativa di GFP-syntaxin-13 wild type e GFP-syntaxin-13 delta-129 ai melanosomi, è stato utilizzato il software Fiji e l'analisi è stata eseguita con il plugin JACOP.
Il coefficiente di sovrapposizione di Mander misurato, cioè MOC, tra GFP-syntaxin-13 delta-129 con TYRP1 è circa 1,5 volte superiore rispetto a GFP-syntaxin-13 wild type con TYRP1. È interessante notare che TYRP1 ha mostrato valori MOC 2,9 volte più alti con GFP-syntaxin-13 delta-129 rispetto a GFP-syntaxin-13 wild type. Questi dati indicano che la localizzazione dei melanosomi GFP-syntaxin-13 delta-129 è relativamente più alta rispetto al tipo wild GFP-syntaxin-13 allo stato stazionario.
Quantificazione della sintassiin-13 localizzazione wild type degli endosomi di riciclo. La microscopia a immunofluorescenza del tipo selvatico GFP-syntaxin-13 ha mostrato la colocalizzazione con la nota proteina endosomiale di riciclaggio Rab11. Il MOC tra GFP-syntaxin-13 wild type con mCherry-Rab11 è circa 1,4 volte più alto rispetto a mCherry-Rab11 con GFP-syntaxin-13 wild type.
Per misurare il numero e la lunghezza dei tubuli endosomiali GFP-syntaxin-13 wild type positivi, è stato utilizzato il software Fiji come descritto nella sezione del protocollo. mCherry-Rab11 è usato un controllo positivo negli esperimenti. I melanociti trasfettati con GFP-syntaxin-13 wild type hanno mostrato un numero maggiore di tubuli per cellula rispetto alle cellule che esprimono mCherry-Rab11.
Tuttavia, i tubuli sono ridotti alla coespressione sia di GFP-syntaxin-13 wild type che di mCherry-Rab11 nelle cellule. Il settimo passo è la quantificazione del numero tubolare e della lunghezza degli endosomi di riciclaggio. I tubuli sono ridotti alla coespressione sia di GFP-syntaxin-13 wild type che di mCherry-Rab11 nelle cellule.
È interessante notare che la lunghezza media dei tubuli sia dal tipo selvatico GFP-syntaxin-13 che da mCherry-Rab11 è paragonabile l'una all'altra nelle cellule che si esprimono individualmente o insieme. Insieme, questi dati suggeriscono che GFP-syntaxin-13 wild type localizza il riciclaggio degli endosomi come simili a Rab11. Questo studio ha dimostrato che la consegna N-terminale del mutante sintassina-13, cioè GFP-syntaxin-13 delta-129, localizza in melanosomi GFP-syntaxin-13 delta-129 può essere utilizzata come reporter per il traffico vescicolare dal riciclaggio degli endosomi alla superficie cellulare e LRO.
Al contrario, GFP-syntaxin-13 wild type si localizza nel riciclaggio degli endosomi come simili a Rab11. Questo studio ha dimostrato che GFP-syntaxin-13 wild type potrebbe anche essere utilizzato per marcare gli endosomi di riciclaggio nei melanociti. GFP-syntaxin-13 wild type può essere un marcatore endosomiale di riciclaggio migliore di Rab11, poiché Rab11 altera la dinamica endosomiale.
Tutti insieme, GFP-syntaxin-13 wild type agisce come un potenziale marcatore endosomiale di riciclaggio per studiare la dinamica in condizioni di stato stazionario.
