SNAREの人身売買を用いたリサイクル用の子宮体を研究し、分析するための顕微鏡ベースのアッセイ。これらは皮膚メラノサイトです。細胞の中に見える黒い色のオルガネラはメラノソームと呼ばれます。
メラノソームはリソゾーム関連小器官またはLROと呼ばれるオルガネラのクラスとして知られています。循環性の循環は、初期の尿細管状小胞小器官であり、すべての細胞タイプの中で子宮内ソームを選別する。これらのオルガネラはメラノソームの生物形成において重要な役割を果たす, メラノサイトによって生成されるリゾゾーム関連小器官.
エンドーソームのリサイクルは、メラノサイト特有の貨物を形成中に早期のメラノソームに送達します。いくつかの症候群で観察される循環性の増殖性の生成は、皮膚、髪、および眼の色素沈着の細胞である。したがって、子宮体をリサイクルするダイナミクスを研究することは、正常および疾患状態におけるこれらのオルガネラの機能を理解するのに有用である。
本研究は、逮捕SNARE構文-13を用いて、循環型の内ソームのダイナミクスを測定することを目的としている。最初のステップは、前処理されたカバーリップ上のマウスメラノサイトの播種です。基質膜マトリックス媒体でペトリ皿にガラスカバーリップをコーティングします。
そして、ティッシュ培養フードで15分間乾燥させます。使用前に1X PBSでカバーリップを1回洗ってください。50〜60%のコンピテンシーで基部膜媒体コーティングカバーリップ上の細胞を播種します。
完全なRPMI培地で、常に200ナノモルのPMAをメッキ細胞懸濁液に添加してください。細胞を播種した後、CO2インキュベーターに細胞を含む皿を12〜24時間インキュベートする。第2のステップは、シンサクシン-13プラスミドを有する細胞のトランスフェクションである。
DNAとトランスフェクション試薬を含む先端をインキュベートし、5分間混合し、ピペット処理を繰り返さずに混合します。室温で30分間、10分おきに手でチューブをタップします。インキュベーション中に、細胞を1X PBSで2回、OPTI-MEMで1回洗浄し、細胞に1マイルのOPTI-MEMを加えます。
インキュベーションのポスト30分、トランスフェクション試薬DNAを滴下して皿を覆って細胞に加える。細胞を摂氏37度で6時間インキュベートします。トランスフェクション試薬でOPTI-MEM培地を吸引し、PMAの200ナノモルを添加した完全なRPMI培地を添加する。
48時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。第3のステップは、細胞の固定です。以下の手順は、組織培養フードの外側で行われます。
48時間のトランスフェクションの後、1X PBSで細胞を2回洗浄し、3%ホルムアルデヒドで30分間細胞を固定します。固定後、細胞を1X PBSで2回洗浄し、さらに使用するまでカバーリップを1X PBSに保管します。あるいは、細胞をガラス板に取り付けたり、摂氏4度で貯蔵したりすることもできます。
第4のステップは、細胞の免疫染色である。湿気の多いチャンバーを準備します。ペトリ皿のマウスフィルター紙にパラフィルムカットピースを置きます。
アルミホイルで覆います。25マイクロリットルの一次抗体溶液を調製します。1~200の希釈で抗体を追加します。
湿気の多いチャンバーのパラフィルムにドロップとしてこのソリューションを追加します。慎重に鉗子でカバースリップを持ち上げます。一次抗体染色液の滴下でそれを反転し、次に湿気の多いチャンバーの蓋を覆う。
室温で30分間インキュベートします。同様に、二次抗体溶液を1~500の希釈で調製し、湿気の多いチャンバーのカバースリップの隣のパラフィルムに置きます。核を染色する場合は、溶液に120,000~130,000の希釈でDAPIを加えます。
鉗子を使用して、慎重に一次抗体溶液からカバースリップをピックアップし、1X PBSに2回浸します。ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップの余分なPBSを取り除きます。二次抗体染色液を湿気の多いチャンバーに置き、溶液中に蛍光染色抗体が存在するため、光にさらしません。
インキュベーション後、二次抗体溶液からカバースリップを慎重に取り出し、1X PBSに2回浸します。さらに、ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップ上の余分なPBSを取り除きます。12マイクロリットルのイメージング試薬をガラススライドに置き、染色カバースリップを取り付け試薬に慎重に置きます。
ティッシュペーパーのガラススライドを反転させ、軽く押します。次に、蛍光顕微鏡を用いてカバースリップを画像化し、ImageJを用いて画像を解析する。第六ステップは、循環性の内在性タンパク質とメラノソームの間の重複の定量です。
メラノソームとのシンサクシン-13 delta-129の共局化の定量化。マウス野生型メラノサイトにおけるシンコシン-13の免疫蛍光顕微鏡は、小胞および管状構造として局在するGFP-syntaxin-13野生型を示した。GFP-syntaxin-13 delta-129は、細胞表面に加えてリング状の構造を局所化します。
また、細胞内環様GFP-syntaxin-13 delta-129は、明るい視野画像メラノソームにおけるメラノソームタンパク質TYRP1との共局在化を示した。前に示したように、過剰発現GFP-syntaxin-13野生型のコホートはメラノソームで観察される。GFP-syntaxin-13野生型とGFP-syntaxin-13 delta-129をメラノソームに対して相対的に局在化するために、フィジーのソフトウェアを使用し、JACOPプラグインで分析を行いました。
測定されたマンダーのオーバーラップ係数、すなわちMOCは、TYRP1を有するGFP-syntaxin-13デルタ-129の間で、TYRP1のGFP-syntaxin-13野生型と比較して約1.5倍高い。興味深いことに、TYRP1はGFP-シンタックス13の野生型と比較してGFP-syntaxin-13 delta-129で2.9倍高いMOC値を示した。これらのデータは、GFP-syntaxin-13 delta-129メラノソームの局在化が、安定状態でのGFP-syntaxin-13野生型と比較して比較的高いことを示している。
リサイクルエンドーソームのシンセクシン-13野生型の局在化の定量化。GFP-シンセニン-13野生型の免疫蛍光顕微鏡は、既知の循環型の内皮タンパク質Rab11と共局在化を示した。mCherry-Rab11を持つGFP-シンセニン-13野生型の間のMOCは、GFP-syntaxin-13野生型のmCherry-Rab11と比較して約1.4倍高い。
GFP-syntaxin-13野生型正の内皮細管の数と長さを測定するために、フィジーのソフトウェアはプロトコルセクションで説明されているように使用されました。mCherry-Rab11は実験において陽性対照を用いる。GFP-syntaxin-13野生型にトランスフェクトしたメラノサイトは、mCherry-Rab11を発現する細胞と比較して、細胞当たりの細管数が多いことを示した。
しかし、細胞内のGFP-シンセニン-13野生型とmCherry-Rab11の両方の共発現時に細管が減少する。第7のステップは、エンドソームの管内数と長さのリサイクルの定量化です。この尿細管は、細胞内のGFP-シンタックス13型とmCherry-Rab11の両方を共発現させると減少する。
興味深いことに、GFP-シンタックス-13野生型およびmCherry-Rab11の両方からの平均細管長は、個別または一緒に発現する細胞において互いに匹敵する。これらのデータを組み合わせることで、GFP-syntaxin-13野生型はRab11と同様に内性体をリサイクルするために局所化することを示唆している。この研究は、GFP-syntaxin-13 delta-129であるシンシン13突然変異体のN末端送達は、培養物を細胞表面およびLROにリサイクルすることから、小胞性密売にレポーターとして使用できる可能性のあるメラノソームGFP-syntaxin-13 delta-129に局地化することを示した。
一方、GFP-syntaxin-13野生型は、Rab11と同様に、エンドーソームのリサイクルに局部的に対応しています。この研究は、GFP-syntaxin-13野生型がメラノサイトの内無代性のリサイクル性をマーキングするためにも使用できることを示した。GFP-syntaxin-13野生型は、Rab11が内皮ダイナミクスを変化させるので、Rab11よりも優れた内皮マーカーをリサイクルする可能性があります。
GFP-syntaxin-13野生型は、一緒に、定常状態のダイナミクスを研究するために潜在的な循環性内皮マーカーを作用させる。
