Le test basé sur la microscopie pour étudier et analyser les endosomes de recyclage en utilisant le trafic SNARE. Ce sont des mélanocytes cutanés. Les organites de couleur noire que vous voyez à l’intérieur des cellules sont appelés mélanosomes.
Les mélanosomes sont connus comme une classe d’organites appelés organites apparentés au lysozome ou LRO. Les endosomes de recyclage sont des organites vésiculaires tubulaires issus du début ou du tri des endosomes dans tous les types de cellules. Ces organites jouent un rôle clé dans la biogenèse des mélanosomes, un organite apparenté au lysozome produit par les mélanocytes.
Les endosomes de recyclage livrent la cargaison spécifique au mélanocyte aux mélanosomes prématurés pendant leur formation. la génération d’endosomes de recyclage observée dans plusieurs syndromes est des cellules dans l’hyperpigmentation de la peau, des cheveux et des yeux. Par conséquent, l’étude de la dynamique du recyclage des endosomes est utile pour comprendre la fonction de ces organites dans des conditions normales et pathologiques.
Cette étude vise à mesurer la dynamique des endosomes de recyclage à l’aide de la syntaxe SNARE-13. La première étape est l’ensemencement de mélanocytes de souris sur des couvertures prétraitées. Enduire les couvercles de verre dans une boîte de Petri dans un milieu de matrice de membrane basale.
Et séchez-le dans la hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes. Lavez les couvercles une fois avec 1X PBS avant utilisation. Ensemencez les cellules sur les couvertures recouvertes de milieu de membrane basale à 50 à 60% de compétence.
Ajoutez toujours 200 nanomolaires de PMA à la suspension de cellules plaquées dans un milieu RPMI complet. Après avoir ensemencé les cellules, incuber le plat contenant des cellules dans un incubateur à CO2 pendant 12 à 24 heures. La deuxième étape est la transfection des cellules avec des plasmides de syntaxine-13.
Incuber les pointes contenant de l’ADN et du réactif de transfection, mélanger pendant cinq minutes et mélanger sans pipetage répété. Tapotez le tube à la main toutes les dix minutes pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 1X PBS, une fois avec OPTI-MEM, puis ajoutez 1 mil d’OPTI-MEM aux cellules.
Après 30 minutes d’incubation, ajoutez le mélange d’ADN du réactif de transfection aux cellules de manière goutte à goutte en recouvrant le plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant six heures. Aspirer le milieu OPTI-MEM avec un réactif de transfection et ajouter un milieu RPMI complet complété par 200 nanomolaires de PMA.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. La troisième étape est la fixation des cellules. Veuillez noter que la procédure suivante est effectuée à l’extérieur de la hotte de culture tissulaire.
Après 48 heures de transfection, lavez les cellules deux fois avec 1X PBS, puis fixez les cellules avec 3% de formaldéhyde pendant 30 minutes. Après la fixation, lavez les cellules deux fois avec 1X PBS et stockez les couvercles dans 1X PBS jusqu’à une utilisation ultérieure. Alternativement, les cellules peuvent être montées sur des plaques de verre ou stockées à quatre degrés Celsius.
La quatrième étape est l’immunocoloration des cellules. Préparez une chambre humide. Placez un morceau découpé de parafilm sur un papier filtre de souris dans une boîte de Pétri.
Couvrir avec du papier d’aluminium. Préparer 25 microlitres de solution d’anticorps primaires. Ajouter l’anticorps à une dilution de un à 200.
Ajouter cette solution sous forme de goutte sur le parafilm dans la chambre humide. Soulevez délicatement le couvercle avec une pince. Inversez-le sur la goutte de la solution de coloration d’anticorps primaires, puis couvrez le couvercle de la chambre humide.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. De même, préparez la solution d’anticorps secondaire à une dilution de un à 500 et placez-la sur le parafilm à côté du couvercle dans la chambre humide. Pour colorer le noyau, ajouter DAPI à une dilution de 120 000 à 130 000 à la solution.
À l’aide d’une pince, ramassez soigneusement le couvercle de la solution d’anticorps primaire et trempez-le deux fois dans 1X PBS. Appuyez sur le couvercle sur le papier de soie pour enlever l’excès de PBS sur le couvercle. Placez-le sur la solution de coloration secondaire des anticorps dans la chambre humide et ne l’exposez pas à la lumière, en raison de la présence d’anticorps teints par fluorescence dans la solution.
Après l’incubation, ramassez soigneusement le couvercle de la solution d’anticorps secondaire, puis trempez-le deux fois dans 1X PBS. De plus, appuyez sur le couvercle sur le papier de soie pour enlever l’excès de PBS sur le couvercle. Placez 12 microlitres de réactif d’imagerie sur une lame de verre et placez soigneusement le couvercle taché sur le réactif de montage.
Inverser la lame de verre sur le papier de soie, puis appuyer doucement. Ensuite, imagez le couvercle à l’aide d’un microscope à fluorescence et analysez les images à l’aide d’ImageJ. La sixième étape est la quantification du chevauchement entre les protéines localisées de l’endosome de recyclage et les mélanosomes.
Quantification de la colocalisation de la syntaxine-13 delta-129 avec les mélanosomes. La microscopie par immunofluorescence de la syntaxine-13 dans des mélanocytes de type sauvage de souris a montré que la GFP-syntaxine-13 de type sauvage était localisée sous forme de structures vésiculaires et tubulaires. Et GFP-syntaxin-13 delta-129 localise les structures en forme d’anneau en plus de la surface de la cellule.
En outre, la GFP-syntaxine-13 delta-129 de type anneau intracellulaire a montré une colocalisation avec la protéine de mélanosome TYRP1 dans des mélanosomes imagés en champ lumineux. Comme montré précédemment, une cohorte de type sauvage surexprimé GFP-syntaxin-13 est observée dans les mélanosomes. Pour mesurer la localisation relative du type sauvage GFP-syntaxin-13 et du GFP-syntaxin-13 delta-129 aux mélanosomes, le logiciel Fiji a été utilisé et l’analyse a été effectuée avec le plugin JACOP.
Le coefficient de chevauchement de Mander mesuré, c’est-à-dire MOC, entre GFP-syntaxin-13 delta-129 et TYRP1 est environ 1,5 fois plus élevé que le type sauvage GFP-syntaxin-13 avec TYRP1. Fait intéressant, TYRP1 a montré des valeurs MOC 2,9 fois plus élevées avec GFP-syntaxin-13 delta-129 par rapport au type sauvage GFP-syntaxin-13. Ces données indiquent que la localisation des mélanosomes GFP-syntaxin-13 delta-129 est relativement plus élevée que celle du type sauvage GFP-syntaxin-13 à l’état stable.
Quantification de la localisation de type sauvage syntaxine-13 des endosomes de recyclage. La microscopie par immunofluorescence de type sauvage GFP-syntaxine-13 a montré une colocalisation avec la protéine endosomique de recyclage connue Rab11. Le MOC entre le type sauvage GFP-syntaxin-13 et le type sauvage mCherry-Rab11 est environ 1,4 fois plus élevé que le type sauvage mCherry-Rab11 avec le type sauvage GFP-syntaxin-13.
Pour mesurer le nombre et la longueur des tubules endosomaux positifs de type sauvage GFP-syntaxin-13, le logiciel Fidji a été utilisé comme décrit dans la section du protocole. mCherry-Rab11 est utilisé comme témoin positif dans les expériences. Les mélanocytes transfectés avec le type sauvage GFP-syntaxin-13 ont montré un nombre plus élevé de tubules par cellule par rapport aux cellules exprimant mCherry-Rab11.
Cependant, les tubules sont réduits lors de la coexpression du type sauvage GFP-syntaxin-13 et de mCherry-Rab11 dans les cellules. La septième étape est la quantification du nombre et de la longueur tubulaires des endosomes de recyclage. Les tubules sont réduits lors de la coexpression du type sauvage GFP-syntaxin-13 et de mCherry-Rab11 dans les cellules.
Fait intéressant, la longueur moyenne des tubules du type sauvage GFP-syntaxin-13 et de mCherry-Rab11 est comparable l’une à l’autre dans les cellules s’exprimant individuellement ou ensemble. Ensemble, ces données suggèrent que le type sauvage GFP-syntaxin-13 se localise pour recycler les endosomes comme similaire à Rab11. Cette étude a montré que l’administration N-terminale du mutant syntaxine-13, c’est-à-dire GFP-syntaxin-13 delta-129, se localise en mélanosomes GFP-syntaxin-13 delta-129 peut éventuellement être utilisé comme rapporteur pour le trafic vésiculeux du recyclage des endosomes à la surface cellulaire et LRO.
En revanche, le type sauvage GFP-syntaxin-13 se localise au recyclage des endosomes comme similaire à Rab11. Cette étude a montré que le type sauvage GFP-syntaxin-13 pourrait également être utilisé pour marquer les endosomes de recyclage dans les mélanocytes. Le type sauvage GFP-syntaxin-13 peut être un meilleur marqueur endosomale de recyclage que Rab11, car Rab11 modifie la dynamique endosomale.
Dans l’ensemble, le type sauvage GFP-syntaxin-13 agit comme un marqueur endosomique de recyclage potentiel pour étudier la dynamique à l’état d’équilibre.
