الورم الدبقي في خط الوسط المنتشر هو ورم دماغي شديد التوغل. تساعد هذه الطريقة على دراسة كيفية هجرة خلايا DMG وغزوها في سياق 3D في الوقت الفعلي مع رؤى محددة حول الدور المحتمل لجزيء الالتصاق الرئيسي. باستخدام كاشف وضع العلامات وجسم مضاد محدد مضاد CD44 ، يمكننا أن ندرس عن طريق تصوير الخلايا الحية تعبير CD44 على غشاء البلازما على خلايا DMG أيضا في الهجرة والغزو ثلاثي الأبعاد.
سلط تطبيق هذه التقنية الضوء على الدور المحتمل ل CD44 في حركة هذه الخلايا ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يمثل هدفا جزيئيا قيما وغازيا. للبدء ، أعد ترطيب ALR بإضافة 100 ميكرولتر من الماء المعقم واخلط المحلول عن طريق الماصة. امزج الجسم المضاد مع ALR في وسط TSM في صفيحة مستديرة القاع متعددة الآبار أو في أنبوب كهرماني وقم بحمايته من الضوء.
تحضير كمية كافية من الوسط لتوزيع 25 ميكرولتر لكل بئر بتركيز الفحص النهائي ثلاث مرات ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تمييع BSR في وسط TSM بتركيز 1.5 مليمولار للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 مليمولار في نهاية الفحص. ثم قم بإزالة 75 ميكرولترا من الوسط برفق وببطء من كل بئر ، وتجنب لمس قاع البئر حيث يجلس NS والتحقق من وجود NS بصريا.
أضف برفق 25 ميكرولترا من مركب الأجسام المضادة BSR و ALR إلى كل بئر واترك مركب الأجسام المضادة ALR يختلط مع الوسط لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. باستخدام مجهر مقلوب ، تأكد من أن كل NS يقع في موقع مركزي في قاع البئر. تجنب تشكيل الفقاعات عن طريق إزالتها باستخدام إبرة.
ضع الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق حتى يصبح قاع الطبق باردا. قم بتوزيع 75 ميكرولترا من BMM لكل بئر عن طريق وضع طرف P200 مبرد مسبقا على الجدار الداخلي للبئر ، وتجنب تكوين الفقاعات ولمس قاع البئر. اترك الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق للسماح ل BMM بالاختلاط مع الوسط.
باستخدام المجهر المقلوب ، تحقق من موقع NS. وإذا لم تكن موجودة مركزيا ، فإن جهاز الطرد المركزي للوحة عند أربع درجات مئوية عند 180 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم انقل اللوحة في أداة تحليل الخلايا الحية الموضوعة داخل الحاضنة المحددة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بمجرد طلاء الآبار ب BMM ، اقطع طرف P200.
خذ 50 ميكرولترا من وسط الخلية و NS من كل بئر محدد وانقله إلى بئر قاع مسطح مطلي. تحقق من وجود وموضع NS في كل بئر بصريا. أضف برفق 50 ميكرولترا من الجسم المضاد BSR و ALR المخفف إلى كل بئر ، وانتظر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح للكواشف بالاختلاط.
وباستخدام مجهر مقلوب ، تأكد من أن معظم NS المكررة تقع في موقع مركزي في البئر. بعد التأكد من عدم وجود أي فقاعة ، انقل اللوحة برفق في أداة تحليل الخلايا الحية كما هو موضح سابقا. في برنامج أداة تحليل الخلايا الحية ، حدد جدول الخيار للحصول عليه ، ثم انقر فوق علامة التبويب علامة الجمع وحدد المسح الضوئي في الموعد المحدد لمسح اللوحات بفواصل زمنية كما هو مذكور في المخطوطة النصية.
في نافذة البرنامج ، قم بإنشاء أو استعادة السفينة ثم انقر فوق الخيار جديد. حدد نوع المسح الكروي ، والمرحلة بالإضافة إلى الحقل الساطع ، وقنوات الصورة الخضراء لمقايسة الغزو ، وهدف 4X. حدد فحص استنساخ التخفيف ، واكتب هدف 4X ، والطور والأخضر لفحص الترحيل.
حدد نوع اللوحة وحدد الآبار المراد مسحها ضوئيا عن طريق تمييزها على خريطة اللوحة ، ثم قم بإعداد تردد المسح. انقر فوق إضافة إلى الجدول الزمني وابدأ الفحص. حدد علامة التبويب إنشاء تعريف تحليل جديد.
ثم حدد غزو كروي أو تطبيق محلل أساسي للغزو والترحيل على التوالي في علامة التبويب. حدد القنوات المناسبة للغزو والترحيل في قناة الصورة. حدد بعض الصور التمثيلية من ثلاثة إلى أربعة آبار لمعاينة إعداد التحليل وتحسينه.
بالنسبة لفحص الغزو ، في علامة تبويب تعريف التحليل ، اضبط إعدادات التطبيق في القنوات الساطعة والخضراء مع الإعدادات المذكورة في مخطوطة النص لإنشاء تجزئة دقيقة بين الخلايا الكروية والغازية. لفحص الترحيل ، اضبط إعدادات التطبيق كما هو مذكور في مخطوطة النص في المرحلة والقنوات الخضراء لإنشاء تجزئة دقيقة بين التقاء الخلايا الخضراء. تحقق من صحة إعدادات التحليل ل NS بالنقر بشكل عشوائي على عدة آبار.
حدد الآبار والنقاط الزمنية لتحليلها. احفظ تعريف التحليل وانقر فوق إنهاء. أظهرت الصور البؤرية الفلورية المناعية التمثيلية لتعبير CD44 في الخلايا الأولية المشتقة من المريض DMG دور CD44 في هجرة الخلايا وغزوها.
تسمح الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D بتصور تعبير CD44. تظهر الإطارات التمثيلية للفاصل الزمني لكل من الهجرة والغزو وجود وغياب إشارة الفلورسنت الخضراء على نفس الخلية التي لوحظت بمرور الوقت ، مما يشير إلى أن تعبير CD44 يتم تشغيله وإيقافه أثناء هجرة الخلايا وغزوها. تتم متابعة عمليات الترحيل والغزو على مدار 96 ساعة ، وتظهر خلايا QCTB-R059 بمستوى عال من CD44.
تم قياس القياس الكمي لتعبير CD44 وزيادته بمرور الوقت بواسطة إشارة التألق الخضراء الشاملة المرتبطة ب ALR لكل من الهجرة والغزو. عندما يتم استخدام الجسم المضاد ل CD44 على الخلايا الحية ، فإنه يؤثر على مورفولوجيا الخلية ، مما يؤدي إلى الانتقال من غزو يشبه اللحمة المتوسطة إلى غزو يشبه الأميبودية وتقليل القدرة الغازية والمهاجرة لهذه الخلايا. الخطوة الأكثر أهمية في هذه الطريقة هي خلط كاشف وضع العلامات مع جسم مضاد ، وإضافة المزيج إلى Matrigel والوسط ، والوصول إلى أداة تصوير الخلايا الحية.
يمكن تنفيذ هذه الطريقة بشكل أكبر عن طريق استخدام اثنين أو أكثر من كواشف الملصقات المميزة والأجسام المضادة للتحقيق في تفاعل خلايا DMG بوساطة الخلايا المباشرة والاتصال. تقدم طريقتنا أدوات جديدة للتحقيق في 3D الآليات الخلوية والجزيئية للهجرة والغزو DMG ، مما يوفر اتجاهات جديدة لتثبيط النمط الظاهري التسلل.
