Hi.In هذا الفيديو سوف تتعلم كيفية إجراء دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي مفرط الاستقطاب لقلب الفأر المثقوب. ديفيد شاؤول ، طالب دكتوراه / دكتوراه في المختبر ، سوف يرشدك خلال التقنيات والإجراءات المختلفة. نتعلم اليوم بروتوكولا لدراسة استقلاب البيروفات الكربوني 13 مفرط الاستقطاب ، جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي 31P NMR.
استقلاب البيروفات يقف على مفترق طرق الأيض الهوائي واللاهوائي. وعلى هذا النحو ، فهي ذات قيمة كبيرة لدراسة حالات القلب المختلفة. لذلك دعونا نبدأ.
يتم عزل قلب الفأر وتفريغه بمخزن مؤقت Krebs-Hensleit ، داخل أنبوب NMR 10 ملم. ثم يتم إدخال القلب في مطياف الرنين المغناطيسي النووي. هناك ، يتم تسجيل طيف 31P لمراقبة طاقة القلب ودرجة الحموضة ، من خلال مراقبة أصداء الأدينوسين ثلاثي الفوسفات والفوسفوكرياتين والفوسفات غير العضوي.
وفي الوقت نفسه، فإن عينة البيروفات المؤشر عليها الكربون-13 في الموضع الأول تكون شديدة الاستقطاب. وبعد حدوث الذوبان ، يتم حقنه في القلب للسماح بقياس اللاكتات والمواد غير العضوية والبيروفات للأنشطة المنظمة في الوقت الفعلي. قبل يوم واحد من التجربة ، قم بإعداد 400 ملليلتر من المخزن المؤقت Krebs-Henseleit المعدل.
كخطوة أولى ، نحل هذه المكونات في الماء المقطر المزدوج. ثم ، ضع هذا المحلول في فقاعة مع خليط الأكسجين هذا لمدة 20 دقيقة ، ثم أضف كلوريد الكالسيوم. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4.
في يوم التجربة ، أضف الجلوكوز والأنسولين. اضبط حمام الماء على 40 درجة مئوية. أدخل الزجاجة المتوسطة مع 200 مل من المخزن المؤقت KH في الحمام.
استخدم المضخة التمعجية لإعادة تدوير المخزن المؤقت KH. اتصل به ، خط تدفق واحد وخطين للتدفق. أدخل خطوط التدفق الداخل والخارج في المخزن المؤقت KH المسخن.
استخدم خلاط الأكسجين مع 95٪ O2 و 5٪ CO2. ثم أدخل خط الأكسجين في المخزن المؤقت KH الساخن. قم بتشغيل المضخة التمعجية واضبطها على وزن تدفق ثابت يبلغ 7.5 ملليلتر في الدقيقة.
نريد معايرة النظام قبل إدخال القلب. لذلك ، أدخل خطوط التدفق الداخلة والخارجة في أنبوب NMR 10 ملم ، وأدخل مسبار درجة الحرارة البصري المتوافق مع الرنين المغناطيسي النووي. أدخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في تجويف المغناطيس.
اضبط خزان التسخين على 42 درجة مئوية واستخدم تسخين الرنين المغناطيسي النووي لضبط درجة الحرارة داخل المغناطيس إلى 37 درجة مئوية. لاحظ أن درجة حرارة الرنين المغناطيسي النووي تتم مراقبتها بالفعل في المخزن المؤقت KH الموجود داخل المغناطيس ، باستخدام قلب درجة حرارة متوافق مع الرنين المغناطيسي النووي. الآن ، يمكننا استخدام التحليل الطيفي 31P لمراقبة إشارة الفوسفات غير العضوي داخل المخزن المؤقت.
هذه هي المعدات المطلوبة للإجراء الجراحي. ضع 100 ملليلتر من المخزن المؤقت KH في الثلج وقم بفقاعته بنفس خليط الأكسجين. تخدير الماوس داخل غرفة الصندوق بنسبة 3.3٪ إيزوفلوران ممزوجة بهواء الغرفة للحث ، بمعدل تدفق 340 ملليلتر في الدقيقة.
نقل الماوس إلى التخدير الأنفي. تقليل إلى 2.9٪ إيزوفلوران بنفس معدل التدفق. اضغط على القدم للتحقق من رد فعل ألم الدواسة السلبي ، وأن الماوس قد تم تخديره بالكامل.
حقن الماوس مع 300 وحدة من هيبارين الصوديوم ، داخل الصفاق. قطع الجلد سنتيمترين تحت عملية الخنجري. قطع جدار البطن لفضح تجويف البطن.
ضع مشبك المقص بين عملية الخنجري وجلد الصدر ، واستخدمه لسحب جدار الصدر وكشف الحجاب الحاجز. ثقب الفص الأيمن من الحجاب الحاجز ثم قطع بقية الحجاب الحاجز. قطع خط الوسط لجدار الصدر مع تجنب ملامسة الأعضاء العميقة مثل القلب والأوعية.
حقن 200 وحدة من هيبارين الصوديوم في البطين الأيسر للقلب. حقن القلب مع 0.1 ملليلتر من 0.5 مولار من KCL لتحقيق السكتة القلبية. سحب أنسجة الغدة الصعترية من الأمام وقطعها من جذورها لكشف الشريان الأورطي تحتها.
حاول إزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة الغدة الصعترية مع تجنب تلف الشريان الأورطي. قم بإزالة أنسجة القفص الصدري المتبقية للسماح بمرور القسطرة الوريدية بحرية. ضع الملقط المنحني أسفل الشريان الأورطي واستخدمه لوضع عقدة خياطة حريرية حول الشريان الأورطي.
ضع ملقط منحني في جذر الأبهر واسحب القلب بشكل سفلي لكشف الشريان الأورطي وتمديده. حقن ثلاثة ملليلتر من محلول KH المثلج البارد في البطين الأيسر لإزالة الجلطات الدموية من الشريان الأورطي وللحفاظ على صلاحية القلب. ضع عدة قطرات على سطح القلب أيضا.
استخدم إبرة القسطرة الوريدية لثقب جدار الشريان الأورطي دون الإضرار بالجدار الخلفي. ثم أدخل القسطرة بالإبرة ، حوالي ثلاثة ملليمترات. بعد ذلك ، قم بإزالة الإبرة وأدخل أنبوب القسطرة في نفس الوقت لمدة خمسة ملليمترات إضافية ولكن تجنب دخول غرفة البطين الأيسر.
ضع لاصق cyanoacrylate في منطقة ثقب الشريان الأورطي ، لمنع أنبوب القسطرة من الانزلاق خارج الشريان الأورطي أثناء شد الخيط. اربط عقدة مزدوجة برفق بين الشريان الأورطي وأنبوب القنية. حقن خمسة ملليلتر إضافية من المخزن المؤقت KH إلى البطين الأيسر والتحقق من أنه يتدفق عبر أنبوب القنية.
هذا يشير إلى أن القنية كانت ناجحة. إزالة الملقط المنحني من جذر الأبهر. افصل القلب عن الأحشاء المحيطة مع تجنب ملامسة عامل القنية وأنسجة القلب.
قم بتوصيل القنية على الفور بحقنة عازلة متدفقة من الثلج البارد. من المهم تجنب إدخال فقاعات الهواء في القلب. إزالة الأنسجة غير القلبية.
في هذه المرحلة ، يجب أن تلاحظ استئناف القلب ينبض. قطع حواف خياطة الحرير المتبقية. في غرفة الرنين المغناطيسي النووي ، افصل القنية عن المحقنة وقم بتوصيلها بمخزن مؤقت 37 درجة KH لنظام التروية.
ثم أدخل القلب في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 10 ملم. ضع القلب في مركز المسبار ثم أدخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي مع القلب إلى تجويف مطياف الرنين المغناطيسي النووي. قم بإجراء الرقاقة "باستخدام إشارة الماء على قناة 1H حتى يتم تحقيق عرض الخط من 10 إلى 20 هرتز.
بعد ذلك ، احصل على أطياف 31P للقلب باستخدام زاوية قلب 50 درجة و TR 1.1 ثانية في حالة مستقرة. تفضل هذه الشروط إشارة ATP ، على إشارات PCr والفوسفات غير العضوي. مراقبة إشارات ATP و PCr ، يعني أن الأنسجة قابلة للحياة داخل مطياف الرنين المغناطيسي النووي.
استخدم برنامج معالجة مخصص لتحليل الأطياف. قم بإجراء التقريب الأسي لسبعة هرتز. استخدم تصحيح خط الأساس ، ثم قم بتعيين إشارة الفوسفوكرياتين إلى سالب 2.5 جزء في المليون.
لاحظ إشارات الفوسفات غير العضوي والفوسفوكرياتين والأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). قم باستقطاب عينة البيروفات ، الموضحة في الموضع الأول بالكربون 13 ، لمدة 80 دقيقة. بعد 80 دقيقة من الاستقطاب، تصبح العينة جاهزة للمحلول.
هذه هي الطريقة التي يحدث الانحلال. حقن محتوى الذوبان في القلب باستخدام نهج التروية المستمرة. تم تصميم هذا النهج لتوصيل البيروفات دون أي انقطاع في نضح الأنسجة ومستوى الأكسجين.
يتم حقن وسائط المحلول التي تحتوي على البيروفات مفرط الاستقطاب في أنبوب مخروطي ، ثم يتم حقنها يدويا في مجازة ، وبعد ذلك ، نوجه التروية عبر المجازة ، ويتدفق محتوى المجازة عبر القلب باستمرار ، وفي النهاية يغسل. نستخدم معدل نضح يبلغ 7.5 ملليلتر في الدقيقة وحجم تجاوز يبلغ 22 ملليلتر. لذلك ، تتدفق الوسائط شديدة الاستقطاب عبر القلب لمدة ثلاث دقائق تقريبا.
في هذه النافذة الزمنية، نستخدم التحليل الطيفي للكربون 13 لقياس إشارات البيروفات واللاكتات والبيكربونات. نستخدم مخطط إثارة يتناوب بين إثارة اللاكتات وإثارة البيكربونات ، بفواصل زمنية مدتها ست ثوان. استخدمنا الإثارة الانتقائية المشبعة للحصول على إشارة الكربون 13.
في هذا النهج ، يكون البيروفات الركيزة متحمسا إلى الحد الأدنى ، في حين أن المستقلبات واللاكتات والبيكربونات متحمسة تماما. مراقبة وتسجيل استقلاب الكربون 13 بيروفات لمدة ثلاث دقائق تقريبا. يتم الانتهاء من التحقيق الأيضي بعد تحلل إشارة البيروفات.
يوضح هذا الشكل أطياف 31P المسجلة من قلب فأر مملوء بمخزن مؤقت KH. يظهر الطيف المكتسب من القلب إشارات ألفا وبيتا وجاما ATP و PCr و Pi.تتكون إشارة Pi من مكونين رئيسيين ، يمثل المكون الموجود في اليسار ، والذي يظهر في حقل أعلى ، إشارة Pi التي ترجع في الغالب إلى المخزن المؤقت KH عند درجة حموضة 7.4. يظهر الحد والمكون الأقل تجانسا في اليمين ، والذي يقع في حقل سفلي ، إشارة Pi الموجودة في بيئة أكثر حمضية.
ينشأ هذا المكون من أنسجة القلب. بعد ذلك ، تم الحصول على إشارة Pi للأنسجة عن طريق طرح إشارة Pi العازلة من إشارة Pi بأكملها. ثم تم تحويله من مقياس جزء في المليون إلى مقياس الأس الهيدروجيني.
يتم فحص الأس الهيدروجيني باستخدام تحليل متعدد المعلمات لإشارة Pi النسيجية عن طريق حساب المتوسط المرجح والوسيط المرجح والحد الأقصى العالمي والانحراف. يوضح هذا الشكل طيف الكربون 13 NMR النموذجي ، الذي تم الحصول عليه باستخدام نهج الإثارة الانتقائية للمنتج مفرط الاستقطاب ، أثناء حقن البيروفات الكربوني 13 مفرط الاستقطاب في قلب الفأر المثقوب. لاحظ إشارات اللاكتات بيروفات وبيكربونات.
يتم اقتطاع إشارة البيروفات هنا للأغراض المعروضة. ترجع التغيرات في شدة إشارة الركيزة والمستقلبات إلى استرخاء T1 ، وتواتر الإثارة ، وخصائص التدفق. بعد ذلك ، يتم رسم الشدة المتكاملة لهذه الإشارات.
بالإضافة إلى ذلك ، رسمنا في دوائر سوداء ، كثافة البيروفات المتكاملة التي تم جمعها من أجل اضمحلال T1 ، ولتأثير إثارة التردد 4D ، باستخدام ثابت وقت اضمحلال فعال يبلغ 32 ثانية. تم العثور على هذا التصحيح لإعطاء ديناميكيات التدفق المتوقعة للركيزة. غسل في ، هضبة ، وغسل.
باستخدام دورة وقت الإشارة المصححة هذه ، اخترنا لمزيد من التحليل ، النافذة الزمنية المميزة باللون الأزرق الفاتح ، حيث كان تركيز البيروفات في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ثابتا وأقصى. تم حساب معدلات LDH و PDH لكل نقطة من النقاط الزمنية المحددة ثم تم حساب المتوسط. يتم توفير القيم الرئيسية لهذا الحقن بوحدات نانومول في الثانية.
باختصار ، لقد أظهرنا نظام التجربة لإجراء دراسات استقلابية بيروفات مفرطة الاستقطاب في قلب الفأر المثقوب. نأمل أن تكون هذه المعلومات مفيدة.
