Hi.In этом видео вы узнаете, как проводить гиперполяризованные МРТ-исследования перфузированного сердца мыши. Дэвид Шаул, доктор медицины / аспирант в лаборатории, проведет вас через различные методы и процедуры. Сегодня мы изучаем протокол изучения метаболизма гиперполяризованного пирувата углерода-13 в сочетании с 31P ЯМР-спектроскопией.
Пируватный метаболизм находится на перекрестке аэробного и анаэробного метаболизма. И как таковой, он представляет большую ценность для изучения различных состояний сердца. Итак, приступим.
Сердце мыши изолировано и перфузировано буфером Кребса-Хенслейта внутри 10-миллиметровой ЯМР-трубки. Затем сердце вставляется в ЯМР-спектрометр. Там регистрируется спектр 31P для наблюдения за сердечной энергетикой и рН путем наблюдения резонансов аденозинтрифосфата, фосфокреатина и неорганического фосфата.
Между тем, образец пирувата, который помечен углеродом-13 в первой позиции, гиперполяризован. А после растворения его вводят в сердце, чтобы можно было измерять лактат, неорганические вещества и пируват организованной деятельности в режиме реального времени. За сутки до эксперимента приготовьте 400 миллилитров модифицированного буфера Кребса-Хенселейта.
В качестве первого шага мы растворяем эти ингредиенты в двойной дистиллированной воде. Затем пузырите этот раствор с этой кислородной смесью в течение 20 минут, а затем добавьте хлорид кальция. Отрегулируйте рН до 7,4.
В день эксперимента добавьте глюкозу и инсулин. Установите водяную баню на 40 градусов по Цельсию. Вставьте среднюю бутылку с 200 миллилитрами буфера KH в ванну.
Используйте перистальтический насос для рециркуляции буфера KH. Подключите к нему одну линию притока и две линии оттока. Вставьте линии притока и выпуска в нагретый буфер KH.
Используйте кислородный смеситель с содержанием 95% O2 и 5% CO2. Затем вставьте кислородную магистраль в нагретый буфер KH. Включите перистальтический насос и отрегулируйте его до постоянного расхода 7,5 миллилитров в минуту.
Мы хотим откалибровать систему, прежде чем вводить сердце. Поэтому вставьте линии притока и выхода в 10-миллиметровую трубку ЯМР и вставьте оптический датчик температуры, совместимый с ЯМР. Вставьте трубку ЯМР в отверстие магнита.
Отрегулируйте нагревательный бак до 42 градусов по Цельсию и используйте нагрев ЯМР, чтобы отрегулировать температуру внутри магнита до 37 градусов по Цельсию. Обратите внимание, что температура ЯМР фактически контролируется в буфере KH, который находится внутри магнита, с использованием ЯМР-совместимого температурного ядра. Теперь мы можем использовать 31P-спектроскопию для наблюдения сигнала неорганического фосфата внутри буфера.
Это оборудование, которое требуется для проведения хирургической процедуры. Поместите 100 миллилитров буфера KH в лед и залейте его той же кислородной смесью. Обезболивайте мышь внутри камеры бокса 3,3% изофлураном, смешанным с комнатным воздухом для индукции, со скоростью потока 340 миллилитров в минуту.
Переведите мышь на назальный наркоз. Уменьшите до 2,9% изофлурана при той же скорости потока. Зажмите ногу, чтобы убедиться в отрицательном болевом рефлексе педали и в том, что мышь полностью обезболивается.
Введите мышке 300 единиц гепарина натрия внутрибрюшинно. Срежьте кожицу на два сантиметра ниже мечевидного отростка. Разрежьте брюшную стенку, чтобы обнажить брюшную полость.
Поместите ножничный зажим между мечевидным отростком и кожей груди и используйте его, чтобы втянуть грудную стенку и обнажить диафрагму. Проколите правый лепесток диафрагмы, а затем отрежьте остальную часть диафрагмы. Разрежьте поперек грудной стенки по средней линии, избегая контакта с более глубокими органами, такими как сердце и сосуды.
Введите 200 единиц гепарина натрия в левый желудочек сердца. Введите в сердце 0,1 миллилитра 0,5 моляра KCL для достижения остановки сердца. Втяните ткань тимуса спереди и отрежьте ее от корня, чтобы обнажить аорту под ней.
Постарайтесь удалить как можно больше ткани тимуса, избегая при этом повреждения аорты. Удалите остаточную ткань грудной клетки, чтобы обеспечить свободный проход для внутривенного катетера. Поместите изогнутые щипцы под аорту и используйте их, чтобы наложить шелковый шовный узел вокруг аорты.
Поместите изогнутые щипцы к корню аорты и втяните сердце ниже, чтобы обнажить и растянуть аорту. Введите три миллилитра ледяного буфера KH в левый желудочек для удаления сгустков крови из аорты и для сохранения жизнеспособности сердца. Также нанесите несколько капель на поверхность сердца.
Используйте внутривенную катетерную иглу, чтобы проколоть артериальную стенку аорты, не повреждая заднюю стенку. Затем вставьте катетер с иглой, примерно на три миллиметра. После этого извлеките иглу и одновременно вставьте трубку катетера еще на пять миллиметров, но избегайте попадания в камеру левого желудочка.
Поместите цианакрилатный клей в область прокола аорты, чтобы катетерная трубка не выскользнула из аорты при затягивании шва. Аккуратно дважды завяжите узел между аортой и канюляционной трубкой. Введите дополнительные пять миллилитров буфера KH в левый желудочек и убедитесь, что он течет через канюляционную трубку.
Это свидетельствует о том, что канюляция прошла успешно. Удалите изогнутые щипцы из корня аорты. Отсоедините сердце от окружающих внутренних органов, избегая контакта с канюляционным агентом и сердечной тканью.
Немедленно подсоедините канюлю к проточному ледяному буферному шприцу KH. Важно избегать попадания пузырьков воздуха в сердце. Удалите несердечные ткани.
На этом этапе следует наблюдать, как сердце возобновляет биение. Обрежьте оставшиеся края шелкового шва. В кабинете ЯМР отсоедините канюлю от шприца и подсоедините ее к буферу KH 37 градусов перфузионной системы.
Затем вставьте сердце в 10-миллиметровую трубку ЯМР. Поместите сердце в центр зонда, а затем вставьте ЯМР-трубку с сердцем в отверстие ЯМР-спектрометра. Выполняйте прокладку, используя сигнал воды на канале 1H, пока не будет достигнута ширина линии от 10 до 20 герц.
Затем получите спектры сердца 31P, используя угол поворота 50 градусов и TR 1,1 секунды в установившемся состоянии. Эти условия благоприятствуют сигналу АТФ по сравнению с сигналами PCr и неорганического фосфата. Наблюдение за сигналами АТФ и PCr означает, что ткань жизнеспособна внутри ЯМР-спектрометра.
Используйте специальную программу обработки для анализа спектров. Выполните экспоненциальное операцию семигерц. Используйте базовую коррекцию, а затем назначьте сигнал фосфокреатина минус 2,5 ppm.
Наблюдайте за сигналами неорганического фосфата, фосфокреатина и АТФ. Поляризуйте образец пирувата, который помечен в первой позиции углеродом 13, в течение 80 минут. После 80 минут поляризации образец готов к раствору.
Так происходит роспуск. Введите растворенное содержимое в сердце, используя метод непрерывной перфузии. Этот подход был разработан для доставки пирувата без какого-либо перерыва на уровень перфузии тканей и оксигенации.
Растворная среда, содержащая гиперполяризованный пируват, вводится в коническую трубку, затем вводится вручную в шунтирование, а затем мы направляем перфузию через шунтирование, и содержимое шунта непрерывно течет через сердце и в конечном итоге вымывается. Мы используем скорость перфузии 7,5 миллилитров в минуту и объем байпаса 22 миллилитра. Таким образом, гиперполяризованные медиа протекают через сердце в течение примерно трех минут.
В этом временном окне мы используем спектроскопию углерода-13 для измерения сигналов пирувата, лактата и бикарбоната. Мы используем схему возбуждения, которая чередуется между возбуждением лактата и возбуждением бикарбоната, с интервалами в шесть секунд. Мы использовали насыщающее селективное возбуждение для получения сигнала углерода-13.
При таком подходе пируват субстрата минимально возбуждается, в то время как метаболиты, лактат и бикарбонат, полностью возбуждаются. Наблюдайте и записывайте метаболизм пирувата углерода-13 в течение примерно трех минут. Метаболическое исследование заканчивается после того, как пируватный сигнал затухает.
На этом рисунке показаны спектры 31P, записанные из сердца мыши, перфузированного буфером KH. Спектр, полученный от сердца, показывает сигналы альфа-, бета- и гамма-АТФ, PCr и Pi.Пи-сигнал состоит из двух основных компонентов: Компонент слева, который появляется в более высоком поле, представляет собой Pi-сигнал, который в основном связан с буфером KH при pH 7,4. Граница и менее однородная составляющая справа, которая находится в нижнем поле, показывает сигнал Pi, который находится в более кислой среде.
Этот компонент возникает из сердечной ткани. Затем был получен Pi-сигнал ткани путем вычитания буферного Pi-сигнала из всего Pi-сигнала. Затем он был преобразован из шкалы ppm в шкалу pH.
pH исследуется с помощью многопараметрического анализа тканевого Pi-сигнала путем вычисления средневзвешенного значения, взвешенной медианы, глобального максимума и асимметрии. На этом рисунке показан типичный спектр ЯМР углерода-13, полученный с использованием метода селективного насыщения-возбуждения гиперполяризованного продукта во время инъекции гиперполяризованного пирувата углерода-13 в перфузированное сердце мыши. Обратите внимание на сигналы лактата, пирувата и бикарбоната.
Пируватный сигнал здесь усечен для отображения целей. Изменения интенсивности сигнала субстрата и метаболитов обусловлены релаксацией Т1, частотой возбуждения и характеристиками потока. Далее строятся графики интегральных интенсивностей этих сигналов.
Кроме того, мы нарисовали черными кругами интегральную интенсивность пирувата, которая была собрана для распада T1 и для эффекта возбуждений 4D-частоты, используя эффективную константу времени распада 32 секунды. Было обнаружено, что эта поправка дает ожидаемую динамику потока для субстрата. Промывка, плато и вымывание.
Используя этот скорректированный временной ход сигнала, мы выбрали для дальнейшего анализа выделенное голубым цветом временное окно, в котором концентрация пирувата в ЯМР-трубке была постоянной и максимальной. Показатели ЛДГ и ФДГ рассчитывались для каждого из выбранных моментов времени, а затем усреднялись. Основные значения для этой инъекции приведены в единицах наномоль в секунду.
Таким образом, мы показали экспериментальную систему для проведения гиперполяризованных пируватных метаболических исследований в перфузированном сердце мыши. Надеемся, что эта информация была полезной.
