Hi.In cette vidéo, vous apprendrez à effectuer des études IRM hyperpolarisées du cœur de souris perfusé. David Shaul, étudiant en médecine / doctorat dans le laboratoire, vous guidera à travers les différentes techniques et procédures. Aujourd’hui, nous apprenons un protocole pour étudier le métabolisme hyperpolarisé du carbone-13 pyruvate, combiné à la spectroscopie RMN 31P.
Le métabolisme du pyruvate se situe au carrefour du métabolisme aérobie et anaérobie. Et en tant que tel, il est d’une grande valeur pour étudier diverses conditions du cœur. Alors, commençons.
Le cœur de souris est isolé et perfusé avec un tampon Krebs-Hensleit, à l’intérieur d’un tube RMN de 10 millimètres. Le cœur est ensuite inséré dans le spectromètre RMN. Là, un spectre 31P est enregistré pour observer l’énergétique cardiaque et le pH, en observant les résonances de l’adénosine triphosphate, de la phosphocréatine et du phosphate inorganique.
Pendant ce temps, un échantillon de pyruvate marqué avec du carbone 13 en première position est hyperpolarisé. Et après la dissolution, il est injecté au cœur pour permettre de mesurer le lactate, les inorganiques et le pyruvate des activités organisées en temps réel. Un jour avant l’expérience, préparez 400 millilitres de tampon Krebs-Henseleit modifié.
Dans un premier temps, nous résolvons ces ingrédients dans de l’eau distillée double. Ensuite, bulle cette solution avec ce mélange d’oxygène pendant 20 minutes, puis ajoutez du chlorure de calcium. Ajustez le pH à 7,4.
Le jour de l’expérience, ajoutez du glucose et de l’insuline. Réglez le bain-marie à 40 degrés Celsius. Insérez le flacon moyen avec 200 millilitres de tampon KH dans le bain.
Utilisez une pompe péristaltique pour recycler le tampon KH. Connectez-vous à elle, une ligne d’entrée et deux lignes de sortie. Insérez les conduites d’entrée et de sortie dans le tampon KH chauffé.
Utilisez un mélangeur d’oxygène contenant 95 % d’O2 et 5 % de CO2. Ensuite, insérez la conduite d’oxygène dans le tampon KH chauffé. Allumez la pompe péristaltique et réglez-la à un débit constant de 7,5 millilitres par minute.
Nous voulons calibrer le système avant d’introduire le cœur. Par conséquent, insérez les conduites d’entrée et de sortie dans un tube RMN de 10 millimètres et insérez une sonde de température optique compatible RMN. Insérez le tube RMN dans l’alésage magnétique.
Ajustez le réservoir de chauffage à 42 degrés Celsius et utilisez le chauffage RMN pour ajuster la température à l’intérieur de l’aimant à 37 degrés Celsius. Notez que la température RMN est en fait surveillée dans le tampon KH qui se trouve à l’intérieur de l’aimant, à l’aide d’un noyau de température compatible RMN. Maintenant, nous pouvons utiliser la spectroscopie 31P pour observer le signal de phosphate inorganique à l’intérieur du tampon.
C’est l’équipement requis pour l’intervention chirurgicale. Placez 100 millilitres de tampon KH dans de la glace et faites-le bouillonner avec le même mélange d’oxygène. Anesthésiez la souris à l’intérieur de la chambre de boîte avec 3,3% d’isoflurane mélangé à de l’air ambiant pour l’induction, à un débit de 340 millilitres par minute.
Transférer la souris sous anesthésie nasale. Réduire à 2,9 % l’isoflurane au même débit. Pincez le pied pour vérifier un réflexe de douleur de pédale négatif, et que la souris est complètement anesthésiée.
Injectez à la souris 300 unités d’héparine sodique, par voie intrapéritonéale. Coupez la peau deux centimètres en dessous du processus xiphoïde. Coupez la paroi abdominale pour exposer la cavité abdominale.
Placez une pince à ciseaux entre le processus xiphoïde et la peau de la poitrine et utilisez-la pour rétracter la paroi thoracique et exposer le diaphragme. Percez le lobe droit du diaphragme, puis coupez le reste du diaphragme. Coupez à travers la ligne médiane de la paroi thoracique tout en évitant le contact avec des organes plus profonds tels que le cœur et les vaisseaux.
Injectez 200 unités d’héparine de sodium dans le ventricule gauche du cœur. Injectez au cœur 0,1 millilitre de 0,5 molaire de KCL pour obtenir un arrêt cardiaque. Rétractez le tissu du thymus antérieurement et coupez-le de sa racine pour exposer l’aorte en dessous.
Essayez d’enlever autant de tissu thymus que possible tout en évitant d’endommager l’aorte. Retirer le tissu résiduel de la cage thoracique pour permettre le libre passage du cathéter intraveineux. Placez la pince incurvée sous l’aorte et utilisez-la pour placer un nœud de suture en soie autour de l’aorte.
Placez une pince incurvée à la racine aortique et rétractez le cœur vers le bas pour exposer et étirer l’aorte. Injectez trois millilitres de tampon KH glacé au ventricule gauche pour éliminer les caillots sanguins de l’aorte et préserver la viabilité cardiaque. Placez également plusieurs gouttes sur la surface du cœur.
Utilisez une aiguille de cathéter intraveineuse pour percer la paroi artérielle de l’aorte sans endommager la paroi postérieure. Ensuite, insérez le cathéter avec l’aiguille, environ trois millimètres. Ensuite, retirez l’aiguille et insérez simultanément le tube du cathéter pendant cinq millimètres supplémentaires, mais évitez d’entrer dans la chambre du ventricule gauche.
Placez l’adhésif cyanoacrylate dans la région de ponction de l’aorte, pour empêcher le tube du cathéter de glisser hors de l’aorte tout en serrant la suture. Nouez doucement un nœud entre l’aorte et le tube de canulation. Injectez cinq millilitres supplémentaires de tampon KH au ventricule gauche et vérifiez qu’il circule dans le tube de canulation.
Cela marque que la canulation a réussi. Retirez la pince incurvée de la racine aortique. Déconnectez le cœur des viscères environnants tout en évitant tout contact avec l’agent de canulation et avec le tissu cardiaque.
Connectez immédiatement la canule à une seringue tampon KH glacée qui coule. Il est important d’éviter l’introduction de bulles d’air dans le cœur. Enlever le tissu non cardiaque.
À ce stade, vous devriez observer le cœur reprendre les battements. Coupez les bords de suture de soie restants. Dans la salle RMN, déconnectez la canule de la seringue et connectez-la au tampon 37 degrés KH du système de perfusion.
Ensuite, insérez le cœur dans le tube RMN de 10 millimètres. Placez le cœur au centre de la sonde, puis insérez le tube RMN avec le cœur dans l’alésage du spectromètre RMN. Effectuer le shim en utilisant le signal d’eau sur le canal 1H jusqu’à ce que la largeur de ligne de 10 à 20 hertz soit atteinte.
Ensuite, acquérir des spectres 31P du cœur en utilisant un angle de retournement de 50 degrés et TR de 1,1 seconde à l’état d’équilibre. Ces conditions favorisent le signal de l’ATP, par rapport aux signaux de PCr et de phosphate inorganique. L’observation des signaux de l’ATP et du PCr signifie que le tissu est viable à l’intérieur du spectromètre RMN.
Utilisez un programme de traitement dédié pour analyser les spectres. Effectuer une upérisation exponentielle de sept hertz. Utilisez la correction de base, puis attribuez le signal de phosphocréatine à moins 2,5 ppm.
Observez les signaux de phosphate inorganique, de phosphocréatine et d’ATP. Polariser l’échantillon de pyruvate, qui est marqué dans la première position avec du carbone 13, pendant 80 minutes. Après 80 minutes de polarisation, l’échantillon est prêt pour la solution.
C’est ainsi que la dissolution se produit. Injecter le contenu de dissolution dans le cœur en utilisant l’approche de perfusion continue. Cette approche a été conçue pour délivrer le pyruvate sans interruption du niveau de perfusion et d’oxygénation des tissus.
Le milieu de solution qui contient le pyruvate hyperpolarisé est injecté dans un tube conique, puis injecté manuellement à un pontage, puis nous dirigeons la perfusion à travers le pontage, et le contenu de dérivation circule dans le cœur en continu, et finit par s’écouler. Nous utilisons un taux de perfusion de 7,5 millilitres par minute et un volume de dérivation de 22 millilitres. Ainsi, les médias hyperpolarisés circulent dans le cœur pendant environ trois minutes.
Dans cette fenêtre temporelle, nous utilisons la spectroscopie du carbone 13 pour mesurer les signaux de pyruvate, de lactate et de bicarbonate. Nous utilisons un schéma d’excitation qui alterne entre l’excitation du lactate et l’excitation au bicarbonate, avec des intervalles de six secondes. Nous avons utilisé l’excitation sélective saturante pour acquérir le signal de carbone 13.
Dans cette approche, le substrat pyruvate est peu excité, tandis que les métabolites, le lactate et le bicarbonate, sont complètement excités. Observez et enregistrez le métabolisme du carbone 13 pyruvate pendant environ trois minutes. L’investigation métabolique est terminée après la désintégration du signal pyruvate.
Cette figure montre des spectres 31P enregistrés à partir d’un cœur de souris perfusé avec un tampon KH. Le spectre acquis du cœur, montre les signaux de alpha, bêta et gamma ATP, PCr et Pi.Le signal Pi est composé de deux composants principaux, Le composant à gauche, qui apparaît dans un champ plus élevé, représente le signal Pi qui est principalement dû au tampon KH à un pH de 7,4. La bordure et la composante moins homogène à droite, qui est dans un champ inférieur, montre le signal Pi qui est dans un environnement plus acide.
Ce composant provient du tissu cardiaque. Ensuite, le signal Pi du tissu a été obtenu en soustrayant le signal Pi tampon de l’ensemble du signal Pi. Il a ensuite été converti d’une échelle ppm à une échelle de pH.
Le pH est étudié à l’aide d’une analyse multiparamétrique du signal Pi tissulaire en calculant la moyenne pondérée, la médiane pondérée, le maximum global et l’asymétrie de l’asymétrie . Cette figure montre le spectre RMN typique du carbone 13, obtenu en utilisant l’approche d’excitation saturante sélective du produit hyperpolarisé, lors de l’injection de pyruvate de carbone 13 hyperpolarisé dans le cœur de souris perfusé. Remarquez les signaux de pyruvate de lactate et de bicarbonate.
Le signal pyruvate est tronqué ici à des fins d’affichage. Les changements dans l’intensité du signal du substrat et des métabolites sont dus à la relaxation T1, à la fréquence d’excitation et aux caractéristiques d’écoulement. Ensuite, les intensités intégrées de ces signaux sont tracées.
De plus, nous avons tracé en cercles noirs, l’intensité intégrée du pyruvate qui a été recueillie pour la désintégration T1 et pour l’effet des excitations de fréquence 4D, en utilisant une constante de temps de désintégration effective de 32 secondes. Cette correction s’est avérée obtenir la dynamique d’écoulement attendue pour le substrat. Lavage, plafonnement et lavage.
En utilisant cette trajectoire temporelle de signal corrigée, nous avons sélectionné, pour une analyse plus approfondie, la fenêtre temporelle qui est mise en évidence en bleu clair, dans laquelle la concentration de pyruvate dans le tube RMN, était constante et maximale. Les taux de LDH et de PDH ont été calculés pour chacun des points temporels sélectionnés, puis la moyenne a été calculée. Les principales valeurs de cette injection sont fournies en unités de nanomole par seconde.
En résumé, nous avons montré le système expérimental pour effectuer des études métaboliques de pyruvate hyperpolarisé dans le cœur de souris perfusé. Nous espérons que ces informations vous ont été utiles.
