Hi.In סרטון זה תלמדו כיצד לבצע מחקרי MR היפרפולריים של לב העכבר המחורר. דוד שאול, דוקטורנט במעבדה, ידריך אתכם בטכניקות ובהליכים השונים. כיום אנו לומדים פרוטוקול לחקר מטבוליזם היפרפולרי של פחמן-13 פירובט, בשילוב עם ספקטרוסקופיית NMR 31P.
מטבוליזם פירובט עומד בצומת של מטבוליזם אירובי ואנאירובי. וככזה, הוא בעל ערך רב לחקר מצבים שונים של הלב. אז בואו נתחיל.
לב העכבר מבודד ומחורר באמצעות חיץ קרבס-הנסלייט (Krebs-Hensleit buffer), בתוך צינור NMR בקוטר 10 מילימטר. לאחר מכן הלב מוחדר לספקטרומטר NMR. שם, ספקטרום 31P נרשם כדי לצפות באנרגיה הלב ו- pH, על ידי התבוננות בתהודה של אדנוזין טריפוספט, פוספוקריאטין ופוספט אנאורגני.
בינתיים, דגימת פירובט המסומנת בפחמן-13 במיקום הראשון היא היפרפולרית. ולאחר שמתרחשת המסה, הוא מוזרק ללב כדי לאפשר מדידה של לקטט, אנאורגני ופירובט הפעילות המאורגנת בזמן אמת. יום לפני הניסוי, להכין 400 מיליליטר של חיץ Krebs-Henseleit שונה.
כצעד ראשון, אנו פותרים מרכיבים אלה במים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, לבעבע את התמיסה עם תערובת חמצן זו במשך 20 דקות, ולאחר מכן להוסיף סידן כלורי. כוונן את ה- pH ל- 7.4.
ביום הניסוי, להוסיף גלוקוז ואינסולין. כוונו את אמבט המים ל-40 מעלות צלזיוס. הכנס את הבקבוק הבינוני עם 200 מיליליטר של חיץ KH לאמבטיה.
השתמש במשאבה פריסטלטית כדי למחזר את מאגר KH. התחבר אליו, קו זרימה אחד ושני קווי יציאה. הכנס את קווי הזרימה והיציאה למאגר KH המחומם.
השתמשו במערבל חמצן עם 95%O2 ו-5% CO2. לאחר מכן, הכנס את צינור החמצן למאגר KH המחומם. הפעל את המשאבה הפריסטלטית והתאם אותה למשקל זרימה קבוע של 7.5 מיליליטר לדקה.
אנחנו רוצים לכייל את המערכת לפני שמציגים את הלב. לכן, הכנס את קווי הזרימה והזרימה לצינור NMR של 10 מילימטר, והכנס בדיקת טמפרטורה אופטית תואמת NMR. הכנס את צינור ה- NMR למשעמם המגנט.
כוונן את מיכל החימום ל 42 מעלות צלזיוס והשתמש בחימום NMR כדי להתאים את הטמפרטורה בתוך המגנט ל -37 מעלות צלזיוס. שימו לב שטמפרטורת ה-NMR מנוטרת למעשה במאגר KH שנמצא בתוך המגנט, באמצעות ליבת טמפרטורה תואמת NMR. כעת, אנו יכולים להשתמש בספקטרוסקופיית 31P כדי לצפות באות של פוספט אנאורגני בתוך החיץ.
זהו הציוד הנדרש להליך הכירורגי. מניחים 100 מיליליטר של חיץ KH בקרח ומבעבעים אותו עם אותה תערובת חמצן. מרדימים את העכבר בתוך תא הקופסה עם איזופלורן 3.3% מעורבב עם אוויר החדר לאינדוקציה, בקצב זרימה של 340 מיליליטר לדקה.
העבר את העכבר להרדמת האף. הפחיתו ל-2.9% איזופלורן באותו קצב זרימה. צבטו את כף הרגל כדי לוודא רפלקס כאב שלילי בדוושה, ושהעכבר מורדם לחלוטין.
להזריק את העכבר עם 300 יחידות של הפרין נתרן, intraperitoneally. חותכים את העור שני סנטימטרים מתחת לתהליך xiphoid. חותכים את דופן הבטן כדי לחשוף את חלל הבטן.
מניחים מהדק מספריים בין תהליך הקסיפואיד לעור החזה, ומשתמשים בו כדי למשוך את דופן בית החזה ולחשוף את הסרעפת. נקב את האונה הימנית של הסרעפת ולאחר מכן לחתוך את שאר הסרעפת. חתכו לאורך קו האמצע של דופן בית החזה תוך הימנעות ממגע עם איברים עמוקים יותר כגון הלב וכלי הדם.
להזריק 200 יחידות של הפרין נתרן לחדר השמאלי של הלב. להזריק את הלב עם 0.1 מיליליטר של 0.5 טוחנת של KCL כדי להשיג דום לב. משכו את רקמת בלוטת התימוס קדימה וחתכו אותה מהשורש שלה כדי לחשוף את אבי העורקים שמתחתיה.
נסו להסיר כמה שיותר רקמת תימוס תוך הימנעות מנזק לאבי העורקים. הסר רקמת כלוב צלעות שארית כדי לאפשר מעבר חופשי לצנתר תוך ורידי. הניחו את המלקחיים המעוקלים מתחת לאבי העורקים והשתמשו בו כדי למקם קשר תפר משי סביב אבי העורקים.
מניחים מלקחיים מעוקלים בשורש אבי העורקים ומושכים את הלב בנחיתות כדי לחשוף ולמתוח את אבי העורקים. הזריקו שלושה מיליליטר של חיץ KH קר כקרח לחדר השמאלי כדי להסיר קרישי דם מאבי העורקים ולשמור על יכולת הקיום של הלב. יש לטפטף מספר טיפות גם על משטח הלב.
השתמש במחט קטטר תוך ורידי כדי לנקב את הקיר העורקי של אבי העורקים מבלי לפגוע בדופן האחורית. לאחר מכן, הכנס את הצנתר עם המחט, כשלושה מילימטרים. לאחר מכן, הוציאו את המחט והכניסו בו זמנית את צינור הצנתר לחמישה מילימטרים נוספים, אך הימנעו מכניסה לחדר החדר השמאלי.
הניחו דבק ציאנואקרילט באזור הנקב של אבי העורקים, כדי למנוע מצינור הצנתר להחליק החוצה מאבי העורקים תוך הידוק התפר. קשרו קשר כפול בעדינות בין אבי העורקים לצינור הקנולציה. הזריקו חמישה מיליליטר נוספים של חיץ KH לחדר השמאלי וודאו שהוא זורם דרך צינור הקנולציה.
זה סימן שהקנולציה הצליחה. הסר את המלקחיים המעוקלים משורש אבי העורקים. נתקו את הלב מהקרביים שמסביב תוך הימנעות ממגע עם סוכן הקנולציה ועם רקמת הלב.
חברו מיד את הצינורית למזרק חיץ KH זורם קר כקרח. חשוב להימנע מהכנסת בועות אוויר ללב. הסר רקמה שאינה לבבית.
בשלב זה, אתה צריך לראות את הלב לחדש פועם. חותכים את קצוות תפרי המשי הנותרים. בחדר NMR, נתקו את הצינורית מהמזרק וחברו אותה למאגר 37 מעלות KH של מערכת הזילוח.
לאחר מכן, הכנס את הלב לצינור NMR 10 מ"מ. הניחו את הלב במרכז הגשושית ולאחר מכן הכניסו את צינור ה-NMR עם הלב לבור של ספקטרומטר ה-NMR. בצע shim"באמצעות אות המים על ערוץ 1H עד רוחב קו של 10 עד 20 הרץ מושגת.
לאחר מכן, רכשו ספקטרום 31P של הלב באמצעות זווית היפוך של 50 מעלות ו-TR של 1.1 שניות במצב יציב. תנאים אלה מעדיפים את האות של ATP, על פני האותות של PCr ופוספט אנאורגני. התבוננות באותות של ATP ו- PCr, פירושה שהרקמה בת קיימא בתוך ספקטרומטר NMR.
השתמש בתוכנית עיבוד ייעודית כדי לנתח את הספקטרה. בצע uperization מעריכי של שבעה הרץ. השתמש בתיקון קווי בסיס ולאחר מכן, הקצה את אות הפוספוקריאטין למינוס 2.5 עמודים לדקה.
שימו לב לאותות של פוספט אנאורגני, פוספוקריאטין ו-ATP. קוטב את המדגם של פירובט, כי הוא מסומן במצב הראשון עם פחמן 13, במשך 80 דקות. לאחר 80 דקות של קיטוב, הדגימה מוכנה לפתרון.
כך מתרחשת ההתמוססות. הזריקו את תוכן ההמסה ללב בגישת הזילוח הרציף. גישה זו תוכננה לספק את הפירובט ללא כל הפרעה לרמת הזילוח והחמצון של הרקמה.
מדיית התמיסה המכילה את הפירובט ההיפרפולרי מוזרקת לצינור חרוט, ואז מוזרק ידנית למעקף, ולאחר מכן, אנו מכוונים את הזילוח דרך המעקף, ותכולת המעקפים זורמת דרך הלב ברציפות, ובסופו של דבר נשטפת. אנו משתמשים בקצב זילוח של 7.5 מיליליטר לדקה ובנפח עוקף של 22 מיליליטר. אז, כי התקשורת hyperpolarized זורם דרך הלב במשך כשלוש דקות.
בחלון הזמן הזה אנו משתמשים בספקטרוסקופיית פחמן 13 כדי למדוד אותות פירובט, לקטט וביקרבונט. אנו משתמשים בסכימת עירור העוברת לסירוגין בין עירור לקטט לעירור ביקרבונט, במרווחים של שש שניות. השתמשנו בעירור סלקטיבי רווי כדי להשיג את אות פחמן 13.
בגישה זו, פירובט המצע מעורר באופן מינימלי, בעוד המטבוליטים, לקטט וביקרבונט, מעוררים במלואם. התבוננו ותיעדו מטבוליזם של פחמן 13 פירובט במשך כשלוש דקות. החקירה המטבולית מסתיימת לאחר דעיכת אות הפירובט.
איור זה מראה ספקטרום 31P שהוקלט מלב עכבר המחורר במאגר KH. הספקטרום הנרכש מהלב, מראה את האותות של אלפא, בטא וגמא ATP, PCr ו- Pi.אות Pi מורכב משני רכיבים עיקריים, הרכיב משמאל, המופיע בשדה גבוה יותר, מייצג אות Pi הנובע בעיקר ממאגר KH ב- pH של 7.4. הגבול והרכיב הפחות הומוגני מימין, שנמצא בשדה נמוך יותר, מראה את אות הפאי שנמצא בסביבה חומצית יותר.
מרכיב זה נובע מרקמת הלב. לאחר מכן, אות ה-Pi של הרקמה התקבל על ידי חיסור אות ה-Pi החיץ מאות ה-Pi כולו. לאחר מכן הוא הומר מסולם ppm לסולם pH.
ה- pH נחקר באמצעות ניתוח רב-פרמטרי של אות Pi הרקמה על ידי חישוב הממוצע המשוקלל, החציון המשוקלל, המקסימום הגלובלי וההטיה. איור זה מציג ספקטרום פחמן 13 NMR טיפוסי, המתקבל באמצעות גישת עירור רוויה סלקטיבית של מוצר היפרפולרי, במהלך הזרקת פחמן 13 פירובט היפרפולרי ללב העכבר המחורר. שימו לב לאותות לקטט פירובט וביקרבונט.
אות פירובט נחתך כאן למטרות מוצגות. השינויים בעוצמות האות של המצע והמטבוליטים נובעים מהרפיית T1, ותדירות העירור, ומאפייני הזרימה. לאחר מכן, העוצמות המשולבות של אותות אלה מתוותות.
בנוסף, שרטטנו בעיגולים שחורים את העוצמה המשולבת של פירובט שנאספה עבור דעיכת T1, ועבור ההשפעה של עירורים בתדר 4D, תוך שימוש בקבוע זמן דעיכה אפקטיבי של 32 שניות. תיקון זה נמצא כמניב את דינמיקת הזרימה הצפויה למצע. שטיפה, רמה ושטיפה.
באמצעות מסלול זמן אות מתוקן זה, בחרנו לניתוח נוסף, את חלון הזמן המודגש בכחול בהיר, שבו ריכוז הפירובט בצינור NMR, היה קבוע ומקסימלי. שיעורי LDH ו- PDH חושבו עבור כל אחת מנקודות הזמן שנבחרו ולאחר מכן ממוצעים. הערכים העיקריים עבור הזרקה זו מסופקים ביחידות של nanomole לשנייה.
לסיכום, הראינו את מערכת הניסוי לביצוע מחקרים מטבוליים של פירובט היפרפולרי בלב עכבר מחורר. אנו מקווים כי מידע זה היה שימושי.
