Bu Hi.In videoda, perfüze edilmiş fare kalbinin hiperpolarize MR çalışmalarının nasıl yapılacağını öğreneceksiniz. Laboratuvarda bir MD / PhD öğrencisi olan David Shaul, çeşitli teknikler ve prosedürler boyunca size rehberlik edecektir. Bugün, 31P NMR spektroskopisi ile birlikte hiperpolarize karbon-13 piruvat metabolizmasını incelemek için bir protokol öğreniyoruz.
Piruvat metabolizması, aerobik ve anaerobik metabolizmanın kavşağında durur. Ve bu nedenle, kalbin çeşitli koşullarını incelemek için büyük bir değere sahiptir. Öyleyse başlayalım.
Fare kalbi izole edilir ve 10 milimetrelik bir NMR tüpü içinde Krebs-Hensleit tamponu ile perfüze edilir. Kalp daha sonra NMR spektrometresine yerleştirilir. Orada, adenozin trifosfat, fosfokreatin ve inorganik fosfatın rezonanslarını gözlemleyerek kardiyak enerjileri ve pH'ı gözlemlemek için bir 31P spektrumu kaydedilir.
Bu arada, ilk konumda karbon-13 ile etiketlenmiş bir piruvat örneği hiperpolarize edilir. Çözünme meydana geldikten sonra, laktat, inorganiklerin ölçülmesine izin vermek ve organize aktiviteleri gerçek zamanlı olarak piruvat etmek için kalbe enjekte edilir. Deneyden bir gün önce, 400 mililitre modifiye Krebs-Henseleit tamponu hazırlayın.
İlk adım olarak, bu bileşenleri çift damıtılmış suda çözüyoruz. Daha sonra, bu çözeltiyi bu oksijen karışımıyla 20 dakika boyunca kabarcıklayın ve ardından kalsiyum klorür ekleyin. PH'ı 7,4'e ayarlayın.
Deney gününde, glikoz ve insülin ekleyin. Su banyosunu 40 santigrat dereceye ayarlayın. Orta boy şişeyi banyoya 200 mililitre KH tampon ile yerleştirin.
KH tamponunu geri dönüştürmek için peristaltik pompa kullanın. Bir giriş hattı ve iki çıkış hattı olmak üzere ona bağlanın. Giriş ve çıkış hatlarını ısıtılmış KH tamponuna yerleştirin.
%95 O2 ve %5 CO2 içeren bir oksijen karıştırıcı kullanın. Ardından, oksijen hattını ısıtılmış KH tamponuna yerleştirin. Peristaltik pompayı açın ve dakikada 7,5 mililitre sabit bir akış ağırlığına ayarlayın.
Kalbi tanıtmadan önce sistemi kalibre etmek istiyoruz. Bu nedenle, giriş ve çıkış hatlarını 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin ve NMR uyumlu optik sıcaklık probu takın. NMR tüpünü mıknatıs deliğine yerleştirin.
Isıtma tankını 42 santigrat dereceye ayarlayın ve mıknatısın içindeki sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlamak için NMR ısıtmasını kullanın. NMR sıcaklığının aslında NMR uyumlu bir sıcaklık çekirdeği kullanılarak mıknatısın içindeki KH tamponunda izlendiğini unutmayın. Şimdi, tampon içindeki inorganik fosfat sinyalini gözlemlemek için 31P spektroskopisini kullanabiliriz.
Cerrahi işlem için gerekli olan ekipman budur. 100 mililitre KH tamponunu buza yerleştirin ve aynı oksijen karışımıyla kabarcıklayın. Kutu haznesinin içindeki fareyi, dakikada 340 mililitre akış hızında, indüksiyon için oda havası ile karıştırılmış% 3.3 izofluran ile anestezi altına alın.
Fareyi burun anestezisine aktarın. Aynı akış hızında% 2.9 izofluran'a düşürün. Negatif pedal ağrısı refleksini doğrulamak için ayağınızı sıkıştırın ve farenin tamamen anestezi uygulandığını doğrulayın.
Fareye intraperitoneal olarak 300 birim sodyum heparin enjekte edin. Cildi ksifoid işlemin iki santimetre altında kesin. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için karın duvarını kesin.
Ksifoid süreç ile göğüs derisi arasına makaslı kelepçe yerleştirin ve göğüs duvarını geri çekmek ve diyaframı açığa çıkarmak için kullanın. Diyaframın sağ lobunu delin ve ardından diyaframın geri kalanını kesin. Kalp ve damarlar gibi daha derin organlarla temastan kaçınırken göğüs duvarı orta hattını kesin.
Kalbin sol ventrikülüne 200 ünite sodyum heparin enjekte edin. Kardiyak arrest elde etmek için kalbe 0.1 mililitre 0.5 molar KCL enjekte edin. Timus dokusunu önden geri çekin ve altındaki aortu açığa çıkarmak için kökünden kesin.
Aortun zarar görmesini önlerken mümkün olduğunca çok timus dokusunu çıkarmaya çalışın. İntravenöz kateter için serbest geçişe izin vermek için artık göğüs kafesi dokusunu çıkarın. Kavisli forsepsleri aortun altına yerleştirin ve aortun etrafına ipek dikiş düğümü yerleştirmek için kullanın.
Kavisli forsepsleri aort köküne yerleştirin ve aortu açığa çıkarmak ve germek için kalbi aşağı doğru çekin. Aorttan kan pıhtılarını çıkarmak ve kalp canlılığını korumak için sol ventriküle üç mililitre buz gibi soğuk KH tamponu enjekte edin. Kalp yüzeyine de birkaç damla yerleştirin.
Aortun arteriyel duvarını arka duvara zarar vermeden delmek için intravenöz kateter iğnesi kullanın. Ardından, kateteri iğne ile yaklaşık üç milimetre yerleştirin. Daha sonra, iğneyi çıkarın ve aynı anda kateter tüpünü beş milimetre daha yerleştirin, ancak sol ventrikül odasına girmekten kaçının.
Siyanoakrilat yapıştırıcıyı aortun delinme bölgesine yerleştirin, sütürü sıkarken kateter tüpünün aorttan kaymasını önleyin. Aort ve kanülasyon tüpü arasına yavaşça çift düğüm bağlayın. Sol ventriküle ilave beş mililitre KH tamponu enjekte edin ve kanülasyon tüpünden aktığını doğrulayın.
Bu, kanülasyonun başarılı olduğunu gösterir. Kavisli forsepsleri aort kökünden çıkarın. Kanülasyon ajanı ve kalp dokusu ile temastan kaçınırken kalbi çevreleyen iç organlardan ayırın.
Kanülü hemen buz gibi soğuk bir KH tampon şırıngasına bağlayın. Hava kabarcıklarının kalbe girmesini önlemek önemlidir. Kalp dışı dokuyu çıkarın.
Bu aşamada, kalbin atmaya devam ettiğini gözlemlemelisiniz. Kalan ipek dikiş kenarlarını kesin. NMR odasında, kanülü şırıngadan ayırın ve perfüzyon sisteminin 37 derece KH tamponuna bağlayın.
Ardından, kalbi 10 milimetrelik NMR tüpüne yerleştirin. Kalbi probun merkezine yerleştirin ve ardından NMR tüpünü kalple birlikte NMR spektrometresinin deliğine yerleştirin. Şim'i gerçekleştirin", 1H kanalındaki su sinyalini kullanarak 10 ila 20 hertz çizgi genişliğine ulaşılana kadar elde edilir.
Ardından, kararlı durumda 50 derecelik çevirme açısı ve 1.1 saniyelik TR kullanarak kalbin 31P spektrumlarını elde edin. Bu koşullar, PCr ve inorganik fosfat sinyalleri üzerinde ATP sinyalini desteklemektedir. ATP ve PCr sinyallerini gözlemlemek, dokunun NMR spektrometresinin içinde canlı olduğu anlamına gelir.
Spektrumları analiz etmek için özel bir işleme programı kullanın. Yedi hertz'in üstel uperizasyonunu gerçekleştirin. Temel düzeltmeyi kullanın ve ardından fosfokreatin sinyalini eksi 2,5 ppm'ye atayın.
İnorganik fosfat, fosfokreatin ve ATP sinyallerini gözlemleyin. İlk pozisyonda karbon 13 ile etiketlenmiş piruvat örneğini 80 dakika boyunca polarize edin. 80 dakikalık polarizasyondan sonra, numune çözelti için hazırdır.
Çözülme bu şekilde gerçekleşir. Sürekli perfüzyon yaklaşımını kullanarak çözünme içeriğini kalbe enjekte edin. Bu yaklaşım, piruvatı doku perfüzyonu ve oksijenasyon seviyesinde herhangi bir kesinti olmadan vermek için tasarlanmıştır.
Hiperpolarize piruvat içeren çözelti ortamı konik bir tüpe enjekte edilir, daha sonra manuel olarak bir baypasa enjekte edilir ve daha sonra perfüzyonu bypass yoluyla yönlendiririz ve bypass içeriği sürekli olarak kalpten akar ve sonunda yıkanır. Dakikada 7,5 mililitre perfüzyon hızı ve 22 mililitre baypas hacmi kullanıyoruz. Böylece, hiperpolarize medya yaklaşık üç dakika boyunca kalpten akıyor.
Bu zaman penceresinde, piruvat, laktat ve bikarbonat sinyallerini ölçmek için karbon 13 spektroskopisini kullanıyoruz. Laktat uyarımı ve bikarbonat uyarma arasında altı saniyelik aralıklarla değişen bir uyarma şeması kullanıyoruz. Karbon 13 sinyalini elde etmek için doygun seçici uyarımı kullandık.
Bu yaklaşımda, substrat piruvat minimal olarak uyarılırken, metabolitler, laktat ve bikarbonat tamamen uyarılır. Yaklaşık üç dakika boyunca karbon 13 piruvat metabolizmasını gözlemleyin ve kaydedin. Piruvat sinyali bozunduktan sonra metabolik araştırma tamamlanır.
Bu şekil, KH tamponu ile perfüze edilmiş bir fare kalbinden kaydedilen 31P spektrumlarını göstermektedir. Kalpten elde edilen spektrum, alfa, beta ve gama ATP, PCr ve Pi sinyallerini gösterir.Pi sinyali iki ana bileşenden oluşur, Soldaki bileşen, daha yüksek bir alanda görünen, çoğunlukla 7.4'lük bir pH'ta KH tamponundan kaynaklanan Pi sinyalini temsil eder. Daha düşük bir alanda bulunan sağdaki sınır ve daha az homojen bileşen, daha asidik bir ortamda bulunan Pi sinyalini gösterir.
Bu bileşen kalp dokusundan kaynaklanır. Daha sonra, dokunun Pi sinyali, tampon Pi sinyalinin tüm Pi sinyalinden çıkarılmasıyla elde edildi. Daha sonra bir ppm ölçeğinden pH ölçeğine dönüştürüldü.
PH, ağırlıklı ortalama, ağırlıklı medyan, global maksimum ve çarpıklık hesaplanarak doku Pi sinyalinin multiparametrik bir analizi kullanılarak araştırılır. Bu şekil, perfüze edilmiş fare kalbine hiperpolarize karbon 13 piruvat enjeksiyonu sırasında hiperpolarize ürün seçici doygunluk-uyarma yaklaşımı kullanılarak elde edilen tipik karbon 13 NMR spektrumunu göstermektedir. Laktat piruvat ve bikarbonat sinyallerine dikkat edin.
Piruvat sinyali, görüntülenen amaçlar için burada kesilir. Substratın ve metabolitlerin sinyal yoğunluklarındaki değişiklikler, T1 gevşemesinden, uyarılma sıklığından ve akış özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Daha sonra, bu sinyallerin entegre yoğunlukları çizilir.
Ek olarak, T1 bozunumu için toplanan piruvat entegre yoğunluğu ve 4D frekans uyarımlarının etkisi için, 32 saniyelik etkili bir bozunma zaman sabiti kullanarak siyah daireler halinde çizdik. Bu düzeltmenin, substrat için beklenen akış dinamiklerini verdiği bulunmuştur. Yıkama, plato ve yıkama.
Bu düzeltilmiş sinyal zaman seyrini kullanarak, daha fazla analiz için, NMR tüpündeki piruvat konsantrasyonunun sabit ve maksimum olduğu açık mavi renkle vurgulanan zaman penceresini seçtik. LDH ve PDH oranları, seçilen zaman noktalarının her biri için hesaplandı ve daha sonra ortalaması alındı. Bu enjeksiyon için ana değerler saniyede nanomol birimleri halinde sağlanır.
Özetle, perfüze edilmiş fare kalbinde hiperpolarize piruvat metabolik çalışmaları yapmak için deney sistemini gösterdik. Bu bilgilerin yararlı olduğunu umuyoruz.
