يصف هذا البروتوكول مقايسة قياس الألوان عالية الإنتاجية في مراحل دورة الحياة الثلاث للمثقبيات الكروزي لتحديد الأدوية المرشحة الجديدة لمرض شاغاس. يمكن استخدام هذا لتحديد مركبات المثقبيات بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار. وستشارك في هذا الإجراء رومينا مانارين، وهي فنية في زراعة الخلايا في المختبر من مختبر سرير باميلا.
ابدأ بزراعة بيتا غالاكتوزيداز الذي يعبر عن المثقبيات الكروزية في قارورة زراعة الأنسجة T-25 واحتضنها عند 28 درجة مئوية لزراعتها محوريا. باستخدام غرفة نيوباور ، قم بقياس نمو الطفيليات قبل الزراعة الفرعية. للحفاظ على الثقافات في مرحلة السجل ، فإن الزراعة الفرعية كل 48 إلى 72 ساعة في خمسة ملليلتر من وسط LIT تستكمل بنسبة 10٪ FCS و geneticin في الكبريتات بتركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام لكل ملليلتر.
ثم أغلق الغطاء بإحكام قبل احتضانه عند 28 درجة مئوية في وضع رأسي. من ثقافة مرحلة السجل ، قم بعمل تعليق ل epimastigote في وسط LIT مكمل ب geneticin و sulfate عند التركيز النهائي ل 200،000 خلية لكل ملليلتر epimastigote لكل ملليلتر. بعد توزيع 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر من لوحة بئر 96 ، ماكياج الحجم النهائي من بئر 200 ميكرولتر مع متوسطة.
اجعل تعليق خلية Vero في DMEM مكملا ب 2٪ FCS بالتركيز النهائي ل 100،000 خلية لكل ملليلتر. زرع 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في لوحة زراعة أنسجة البئر 96. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها للالتصاق وفي اليوم التالي ، راقب الخلايا تحت المجهر.
في اليوم التالي ، شطف الطبقة الأحادية من خلية Vero ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من PBS المعقمة. إضافة trypomastigotes metacyclic التي تم الحصول عليها مسبقا. إضافة تعدد العدوى أو MOI من 10-1 في 100 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 2٪ FCS لكل بئر واحتضان لمدة ست ساعات كما هو موضح سابقا.
في نهاية الحضانة ، اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS وأضف 100 ميكرولتر من DMEM بدون أحمر الفينول مع استكمال 2٪ FCS. بعد جعل تعليق خلايا Vero في DMEM ، أضف التركيز النهائي ل 1 مليون خلية لكل ملليلتر. زرع 800،000 خلية في خمسة ملليلتر من الوسط في قوارير T-25 وحضانت بين عشية وضحاها للالتصاق بالخلايا.
بمجرد شطف القارورة باستخدام PBS ، أضف trypomastigotes ، وأضف MOI من 10-1 في خمسة ملليلترات من DMEM مكمل بنسبة 2٪ FCS واحتضنها بين عشية وضحاها كما هو موضح سابقا. في نهاية الحضانة ، اغسل القارورة مرتين باستخدام PBS. أضف خمسة ملليلترات من DMEM الطازج المكمل بنسبة 2٪ FCS واحتضنه لمدة أربعة أيام.
في نهاية الحضانة ، بعد مراقبة supernatant لوجود trypomastigotes تحت المجهر البصري. حدد كمية المثقبيات باستخدام غرفة نيوباور. جمع supernatant في أنبوب 15 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 7،000 مرات G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم تخلص من supernatant وأعد تعليق الكريات في DMEM بدون الفينول الأحمر المكمل ب 2٪ FCS للحصول على تركيز 1 مليون trypomastigotes لكل ملليلتر. بذور 100 ميكرولتر من تعليق المثقبيات لكل بئر في لوحة بئر 96. أضف محلول البنزنيدازول إلى الظواهر أو خلايا فيرو مع الأمستيجوت أو المثقبيات كما هو موضح في مخطوطة النص.
ثم احتضن الظواهر ، وحدد 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة والتريبوماستيغوتس أو خلايا فيرو المصابة بالأماسيغوت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة لفحص قياس الألوان ، قم بإعداد الآبار الفارغة بإضافة 100 ميكرولتر من PBS أو الوسط المقابل. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولتر من محلول الركيزة CPRG و 10 ميكرولترات من محلول المنظفات إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي من 200 ميكرومولار CPRG و 0.1٪ من المنظفات في حجم نهائي من 250 ميكرولتر في كل بئر.
بعد الحضانة ، عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة. في البرنامج ، قم بإنشاء بروتوكول جديد عن طريق تحديد الامتصاص كطريقة الكشف ونقطة النهاية كنوع القراءة ، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك، أضف خطوة قراءة.
اكتب الطول الموجي المحدد وانقر فوق موافق. في قسم تخطيط اللوحة ، ضع علامة على الآبار المراد قراءتها ، وانقر فوق موافق ، وانقر فوق لوحة القراءة ، وانتظر حتى تظهر القيم على الشاشة وقم بتصديرها إلى جدول بيانات لتحليل النتائج وحساب قيم الامتصاص باستخدام الطرح كما هو موضح في المخطوطة. في برنامج التحليل الإحصائي ، ارسم تركيز BZN مقابل الامتصاص عند 595 نانومتر في جدول XY.
قم بتحويل تركيزات BZN إلى قيم لوغاريتمية بالنقر فوق تحليل، وتحديد خيار التحويل، والنقر فوق موافق. للحصول على قيم IC50، انقر فوق تحليل، ومن قائمة تحليل XY حدد ملاءمة منحنى الانحدار غير الخطي، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك ، انتقل إلى نافذة المعلمات ، في علامة تبويب النموذج ، انتقل إلى مجموعة تثبيط استجابة الجرعة من المعادلات المضمنة ، وحدد مثبط السجل مقابل منحدر متغير الاستجابة للمعلمات حيث تترك طريقة استجابة الجرعة جميع علامات التبويب الأخرى عند القيم الافتراضية ثم انقر فوق ، حسنا.
انقر فوق قسم النتائج للعثور على قيمة IC50 و SD وجودة الملاءمة. انقر فوق قسم الرسم البياني للعثور على الرسم البياني XY للتركيز اللوغاريتمي للدواء مقابل قيم الامتصاص وتأكد من أن ملاءمة المنحنى يتم رسمها بيانيا أيضا بلون مختلف. في هذه الدراسة ، كانت قيمة IC50 التي تم الحصول عليها للظهارة حوالي 20 ميكرومولار ، على غرار الدراسات السابقة.
بالإضافة إلى ذلك ، أشارت النتائج إلى نشاط بطانة بيتا غالاكتوزيداز من epimastigotes مع مرور الوقت. من المهم جدا إجراء نسخ متماثلة على الأقل لكل حالة تم اختبارها وتقليلها من الأخطاء في إدارة وحدة التخزين.
