Bu protokol, Chagas hastalığı için yeni ilaç adaylarını belirlemek için Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında yüksek verimli bir kolorimetrik testi tanımlamaktadır. Bu, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, Pamela beşiği laboratuvarından bir laboratuvar hücre kültürü teknisyeni olan Romina Manarin olacak.
Trypanosoma cruzi epimastigotlarını bir T-25 doku kültürü şişesinde eksprese eden beta galaktosidaz kültürleyerek başlayın ve aksenik olarak büyütmek için 28 santigrat derecede inkübe edin. Bir Neubauer odası kullanarak, alt kültürlemeden önce parazit büyümesini ölçün. Kültürleri bir kütük fazında tutmak için, beş mililitre LIT ortamında her 48 ila 72 saatte bir alt kültür, mililitre başına 200 mikrogramlık son bir konsantrasyonda% 10 FCS ve sülfatta genetikin ile desteklenir.
Ardından, dikey konumda 28 santigrat derecede inkübe etmeden önce kapağı güvenli bir şekilde kapatın. Log faz kültüründen, mililitre başına mililitre epimastigot başına 200.000 hücrenin son konsantrasyonunda genetikin ve sülfat ile desteklenmiş LIT ortamında epimastigotun bir süspansiyonunu yapın. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 100 mikrolitre süspansiyon dağıtıldıktan sonra, orta boy 200 mikrolitrelik kuyunun son hacmini yapın.
DMEM'deki Vero hücre süspansiyonunu, mililitre başına 100.000 hücrenin son konsantrasyonunda% 2 FCS ile destekleyin. 96 kuyu doku kültürü plakasında kuyu başına süspansiyonun 100 mikrolitresini tohumlayın. Hücreleri bağlılık için gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün mikroskop altında hücreleri gözlemleyin.
Ertesi gün, Vero hücresi tek katmanını 100 mikrolitre steril PBS ile üç kez durulayın. Daha önce elde edilen metasiklik tripomastigotları ekleyin. Kuyu başına% 2FCS ile desteklenmiş 100 mikrolitre DMEM'de 10-1'lik çok sayıda enfeksiyon veya MOI ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi altı saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkanın sonunda, plakayı PBS ile iki kez yıkayın ve% 2 FCS ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan 100 mikrolitre DMEM ekleyin. DMEM'de Vero hücrelerinin süspansiyonunu yaptıktan sonra, mililitre başına 1 milyon hücrenin son konsantrasyonunu ekleyin. T-25 şişelerinde ortamın beş mililitresinde 800.000 hücre tohumu ve hücre yapışması için gece boyunca kuluçkaya yatırılır.
Şişe PBS ile durulandıktan sonra, tripomastigotlar ekleyin,% 2 FCS ile desteklenmiş beş mililitre DMEM'e 10-1'lik bir MOI ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi gece boyunca inkübe edin. Kuluçka sonunda, şişeyi PBS ile iki kez yıkayın. % 2 FCS ile desteklenmiş beş mililitre taze DMEM ekleyin ve dört gün boyunca inkübe edin.
Kuluçkanın sonunda, optik mikroskop altında tripomastigotların varlığı için süpernatantı gözlemledikten sonra. Bir Neubauer odası kullanarak tripomastigotları sayısallaştırın. Süpernatantı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 7.000 kez G'de santrifüj yapın.
Daha sonra süpernatantı atın ve mililitre başına 1 milyon tripomastigot konsantrasyonu elde etmek için% 2 FCS ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan peletin DMEM'de yeniden askıya alın. 96 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 100 mikrolitre tripomastigot süspansiyonunun tohumu. Metin yazısında açıklandığı gibi epimastigotlara, amastigotlu Vero hücrelerine veya tripomastigotlara benznidazol çözeltisi ekleyin.
Daha sonra epimastigotları inkübe edin, 72 saat boyunca 28 santigrat derece ayarlayın ve tripomastigotlar veya enfekte Vero hücreleri, 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca amastigotlarla enfekte oldu. Kolormetrik analiz için, 100 mikrolitre PBS veya karşılık gelen ortam ekleyerek boş kuyucukları kurun. Daha sonra, her bir kuyucukta 250 mikrolitrelik son hacimde 200 mikromolar CPRG ve% 0.1 deterjan nihai konsantrasyonu elde etmek için her bir kuyucuğa 40 mikrolitre CPRG substrat çözeltisi ve 10 mikrolitre deterjan çözeltisi ekleyin.
Kuluçkadan sonra, iki saat boyunca 37 santigrat derecede, bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak 595 nanometrede absorbans ölçün. Yazılımda, algılama yöntemi olarak absorbansı ve okuma türü olarak bitiş noktasını seçerek yeni bir protokol oluşturun, ardından Tamam'a tıklayın. Ardından, bir okuma adımı ekleyin.
Seçilen dalga boyunu yazın ve Tamam'ı tıklatın. Plaka düzeni bölümünde okunacak kuyucukları işaretleyin, tamam'ı tıklayın ve plakayı oku'ya tıklayın, değerlerin ekranda görünmesini bekleyin ve sonuçları analiz etmek ve makalede açıklandığı gibi çıkarma kullanarak absorbans değerlerini hesaplamak için bunları bir elektronik tabloya aktarın. İstatistiksel analiz yazılımında, XY tablosundaki 595 nanometredeki absorbansa karşı BZN konsantrasyonunu çizin.
Analiz et'i tıklatarak, dönüştür seçeneğini belirleyerek ve Tamam'ı tıklatarak BZN konsantrasyonlarını logaritmik değerlere dönüştürün. IC50 değerlerini elde etmek için analiz et'e tıklayın ve XY analiz listesinden doğrusal olmayan regresyon eğrisi sığdırma'yı seçip Tamam'a tıklayın. Ardından, parametreler penceresine gidin, model sekmesinde, yerleşik denklemlerin doz yanıtı inhibisyon grubuna gidin, doz yanıtı yöntemi diğer tüm sekmeleri varsayılan değerlerde bıraktığından parametreler için log inhibitörü ve yanıt değişken eğimini seçin ve ardından Tamam'ı tıklayın.
IC50 değerini, SD'yi ve uyumun iyiliğini bulmak için sonuçlar bölümüne tıklayın. İlacın logaritmik konsantrasyonunun absorbans değerlerine karşı XY grafiğini bulmak ve eğri uyumunun da farklı bir renkte grafiklendirildiğinden emin olmak için grafik bölümüne tıklayın. Bu çalışmada, epimastigotlar için elde edilen IC50 değeri, önceki çalışmalara benzer şekilde, yaklaşık 20 mikromolar idi.
Ek olarak, sonuçlar zamanla epimastigotların liner beta galaktosidaz aktivitesini göstermiştir. Birim yönetiminde test edilen ve en aza indirilen hataların en azından çoğaltılması çok önemlidir.
