このプロトコルは、シャーガス病の新薬候補を同定するためのトリパノソーマ・クルジの3つのライフサイクル段階におけるハイスループット比色アッセイを記載している。これは、トリパノサイド化合物を容易、迅速、かつ再現可能な方法で同定するために使用することができる。手順を実演するのは、パメラベビーベッドの研究室のラボ細胞培養技術者であるロミナ・マナリンです。
トリパノソーマ・クルジ・エピマスティゴテスを発現するベータ・ガラクトシダーゼをT-25組織培養フラスコ中で培養することから始め、摂氏28度でインキュベートしてアキセニックに成長させる。ノイバウアーチャンバーを用いて、継代培養前に寄生虫の増殖を定量化する。培養物を対数期に維持するために、硫酸塩中の10%FCSおよびジェネチシンを1ミリリットル当たり200マイクログラムの最終濃度で補充した5ミリリットルのLIT培地中で48〜72時間ごとに継代培養する。
その後、キャップをしっかり閉めてから、垂直位置で摂氏28度でインキュベートします。対数期培養から、ジェネティシンと硫酸塩を添加したLIT培地にエピマスチゴートを終濃度200,000細胞当たり200,000細胞/ミリリットルのエピマスチゴート1ミリリットルで懸濁液を作る。96ウェルプレートのウェル当たり100マイクロリットルの懸濁液を分配した後、200マイクロリットルのウェルの最終容量を培地でメイクアップする。
DMEM中のVero細胞懸濁液に、1ミリリットルあたり100,000細胞の最終濃度で2%FCSを添加した。種子1ウェルあたり100マイクロリットルの懸濁液を96ウェル組織培養プレートに入れた。接着のために細胞を一晩インキュベートし、翌日、顕微鏡下で細胞を観察する。
翌日、Vero細胞単分子層を100マイクロリットルの滅菌PBSで3回すすいでください。以前に得られた中環式トリポマスチゴットを加える。ウェルあたり2%FCSを添加した100マイクロリットルのDMEMに10-1の感染またはMOIの多重度を加え、以前に実証したように6時間インキュベートする。
インキュベーションの最後に、PBSでプレートを2回洗浄し、2%FCSを添加したフェノールレッドを含まないDMEMを100マイクロリットル加える。DMEM中でVero細胞懸濁液を作製した後、1ミリリットルあたり100万個の細胞の最終濃度を加える。種子800、000細胞をT−25フラスコ中の5ミリリットルの培地中で、細胞接着のために一晩インキュベートした。
フラスコをPBSですすぎ、トリポマスチゴテスを加え、2%FCSを添加した5ミリリットルのDMEMに10-1のMOIを加え、前述のように一晩インキュベートする。インキュベーションの終わりに、フラスコをPBSで2回洗浄する。2%FCSを添加した5ミリリットルの新鮮なDMEMを加え、4日間インキュベートする。
インキュベーションの最後に、トリポマスチゴテス存在について上清を光学顕微鏡下で観察した後。ノイバウアーチャンバーを用いてトリポマスチゴテスを定量化する。上清を15ミリリットルのチューブに集め、7, 000倍Gで室温で10分間遠心分離する。
次いで、上清を捨て、2%FCSを添加したフェノールレッドを含まないDMEMにペレットを再懸濁し、1ミリリットルあたり100万トリポマスチゴットの濃度を得た。種子100マイクロリットルのトリポマスチゴート懸濁液を1ウェルあたり96ウェルプレートに含む。ベンズニダゾール溶液をエピマスチゴット、アマスチゴットを含むベロ細胞、またはテキスト原稿に記載されているようにトリポマスチゴテスに加える。
その後、エピマスティゴットをインキュベートし、摂氏28度で72時間、トリポマスチゴテスまたは感染したVero細胞を37°Cおよび5%二酸化炭素で24時間アマスチゴテスでインキュベートする。比色アッセイのために、100マイクロリットルのPBSまたは対応する培地を加えてブランクウェルをセットアップする。次に、40マイクロリットルのCPRG基質溶液および10マイクロリットルの洗剤溶液を各ウェルに加え、各ウェルに最終容量250マイクロリットルの最終濃度200マイクロモルCPRGおよび0.1%洗剤を得る。
インキュベーション後、摂氏37度で2時間、マイクロプレート分光光度計を用いて595ナノメートルの吸光度を測定する。ソフトウェアで、検出方法として吸光度を選択し、読み取りタイプとしてエンドポイントを選択して新しいプロトコルを作成し、[OK]をクリックします。次に、読み取りステップを追加します。
選択した波長を入力し、「OK」をクリックします。プレートレイアウトセクションで、読み取るウェルにマークを付け、[OK]をクリックし、[プレートの読み取り]をクリックし、値が画面に表示されるのを待ってスプレッドシートにエクスポートし、結果を分析し、原稿に記載されているように減算を使用して吸光度値を計算します。統計解析ソフトウェアで、BZNの濃度対595ナノメートルでの吸光度をXY表にプロットする。
BZN 濃度を対数値に変換するには、[分析] をクリックし、[変換] オプションを選択して、[OK] をクリックします。IC50値を取得するには、[解析]をクリックし、[XY解析]リストから[非線形回帰カーブフィット]を選択し、[OK]をクリックします。次に、パラメータウィンドウに移動し、[モデル]タブで、組み込み方程式の線量反応抑制グループに移動し、線量反応法としてパラメータの対数阻害剤対応答変数の傾きを選択し、他のすべてのタブをデフォルト値のままにしてからクリックします。
結果セクションをクリックして、IC50値、SD、および適合度を確認します。グラフセクションをクリックして、薬物の対数濃度と吸光度値のXYグラフを見つけ、カーブフィットも別の色でグラフ化されていることを確認します。本研究では、エピマスチゴットについて得られたIC50値は、以前の研究と同様に約20マイクロモルであった。
加えて、結果は、経時的なエピマスチゴットのライナーベータガラクトシダーゼ活性を示した。ボリューム管理において、テストおよび最小化されたエラーの各条件の少なくとも反復を実行することは非常に重要です。
