これは、シアノバクテリアに不慣れな人々が容易にフィコビリソームを分離することを可能にするシンプルで高速なプロトコルです。この技術の利点は、小規模に適合し、実行が容易である点です。これは、モデルと非モデルシノバクテリアの無傷のフィコビリソームを単離するためのシンプルで信頼性の高い効率的な方法です。
750ナノメートルの0.8 ODの細胞培養を1リットルフラスコに移し、500ミリリットルのB-HEPES培地で希釈し、750ナノメートルで0.2のODを達成する。ODが0.8〜1に達するまで摂氏30度で一定の攪拌で培養を成長させ、後期指数成長相を示す。室温で20分間10,000倍gの速度で培養を遠心し、上清を捨てます。
細胞ペレットを懸濁し、0.75モルリン酸カリウムバッファー、pH 7で2回洗浄します。ペレットは、室温で遠心分離することにより50ミリリットル遠心分離管内の細胞を。上清を捨て、0.75モルリン酸カリウムバッファーで細胞を再中断します。
電子バランスでペレットの湿重量を測定し、バッファーの5ミリリットルでペレットの1グラムのウェット重量を再懸濁します。セルサスペンション1ミリリットル、0.1ミリガラスビーズ0.4~0.6グラムを2ミリリットルスクリューキャップバイアルに加えます。ビーズビーターで細胞を30秒間割ります。
室温の水浴でチューブを2分間冷まします。リシス後、500倍gの速度で室温で10秒間バイアルを遠心分離する。15ミリリットルの遠心チューブにピペットで上清を収集します。
0.5ミリリットルの0.75モルリン酸カリウムバッファーでビーズを1回洗浄し、同じ遠心分離管に移します。Lysed細胞懸濁液にTriton X-100を加え、ロッキングシェーカーを室温で40RPM、20分間、または溶液が均質になるまでインキュベートします。チューブを17、210回gで20分間遠心し、上トリトンミセル層を含まない上清を室温で最大1時間保存します。
pH 7で0.75モルリン酸カリウム緩衝液に4つの濃度のスクロースを作ります。40ミリリットル遠心分離管の下部に2.8ミリリットルの2モルショ糖バッファーを配置し、3層のショ糖溶液を重ね合わせます。最後に、上清画分を含むPBSを3ミリリットル加え、得られた勾配を遠心分離する。
超中心化の際に、画層間の分画されたPBSとフィコビリタンパク質を凝縮し、Syn6803およびインターフェースの青いバンドを観察します。0.75モルリン酸カリウムバッファーで画分を繰り返し濃縮し、遠心フィルター単位を膜化することによって、スクロースを除去します。PBSの蛍光を測定するために、濃縮されたPBSサンプルを0.75モルリン酸カリウムバッファーで希釈し、最大500マイクロリットルの体積を作ります。
希釈したPBSサンプルを透明なガラスチューブに加え、チューブを完全に凍結するまで液体窒素で凍結します。液体窒素であらかじめ充填された透明なデュワー容器に凍結チューブを移動します。完全な細胞のリシスは、重心化前に上清および濃い青色緑色を示す。
単離されたPBSのショ糖密度勾配分離は、解離されたフィコビリタンパク質の数画を示し、最も低い画分は無傷のPBSを表す。JSC 1とSyn6803の解離および無傷のPBSからの吸収スペクトルは、フィコシアニンに対応する622ナノメートルで同じピークを有する。また、JSC-1の解離および無傷の両方のPBSにおいて571ナノメートルのフィコエリスリン吸収ピーク。
解離したPBSの発光スペクトルは、Syn6803およびJSC-1で約650ナノメートルで1つの強いピークを有し、フィコシアニンからの放出を表す。651ナノメートルと684ナノメートルの蛍光発光ピークは、フィコシアニンによって収穫されたエネルギーがコア内のアソフィコシアニンおよびApcEである末端エミッタに効率的に移されたことを明らかにした。図は、フィコビリタンパク質サブユニットが強く蛍光を発し、ApcEが弱い蛍光を示したUV照射下の亜鉛染色SDS-PAGEを示し、矢印で示した。
クマシブルー染色は、上端分には他の非PBS水溶性タンパク質が含まれていることを示しており、無傷のPBSおよびSyn6803は、解約されたPBS画分に欠けている矢印で示された顕著なApcEバンドを示す。超遠心分離は、1:3の比率で調製されたスクロース勾配が、1:10の比率で作られた勾配よりも広いバンドを表示することを示しています。細胞を溶起させ、上清を完全にソルボライシスして、より多くのフィコビリソームを得ることが重要です。
他の方法は、クライオEMまたは混合分光法のような、タンパク質構造またはフィコビリソームのタンパク質組成を研究するために使用することができる。
