وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل مجلس الأبحاث السويدي (K2008 - 57X - 20 676-01-3).

<ol>
	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions.">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JL هو شريك في ملكية براءة الاختراع ذات الصلة لاستخدام exosomes وناقلات لنقل الحمض النووي الريبي إلى الخلايا.

عند دراسة محتوى الجزيئية و / أو وظيفة exosomes ، لا بد من استخدام أسلوب العزل عالية الجودة التي توفر العائد المناسب ودرجة ادنى حد ممكن من التلوث. المنهجية المبينة في هذه الورقة هو نهج راسخ لعزل exosomes ودراستهم RNA المحتوى والوظيفة البيولوجية. علاوة على ذلك ، سلط الضوء على أهمية توصيف exosomes معزولة ، عن طريق مزيج من أساليب مختلفة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، التدفق الخلوي ، وصمة عار الغربية. عندما عزل exosomes ، يتم استخدام الطرد المركزي الخطوة الأولى (300 x ج) إلى خلايا الكريات التي قد تكون موجودة في تعليق خلية أو السائل درس البيولوجية. والثانية في 16 الطرد المركزي يحتاج XG 500 إلى أن تكون قوية بما فيه الكفاية لخلايا ميتة بيليه ، وأكبر من الحطام ، والعضيات أفكارك الهيئات الأخرى. بعد هذا الطرد المركزي ، وبعض البروتوكولات تتضمن الخطوة نانو الترشيح ، ولكن بعض الجرداستبعدت estigators هذه الخطوة. ومع ذلك ، فإننا نؤكد على أهمية القضاء على شظايا والحويصلات أكبر من 200 نانومتر ، ولذا نوصي بشدة بما في ذلك خطوة الترشيح. إذا كان هناك حاجة إلى عزل أكثر صرامة ، ويمكن استخدام مرشحات نانومتر 100 ، لكن لاحظ أنه إذا تم استخدام سوائل لزجة ، ويمكن بسهولة أن تصبح هذه المرشحات المسدودة وفقدان المواد exosomal. أيضا ، قد يكون الترشيح 100 نانومتر تؤثر على مورفولوجية exosomes وعلاوة على ذلك إذا exosomes هي على نطاق واسع قد يكون خسر. وبالتالي ، فإن المرشحات 200 نانومتر تبدو مناسبة لعزل exosome. بعد الترشيح ، ويتم استخدام تنبيذ فائق إلزامية في XG 120000 لexosomes الكرية. يمكن أن يكون كذلك مع غسلها exosomes PBS ، منضما إلى الضد حبات مغلفة وغسلها ، أو وضعها على التدرج السكروز لإزالة التلوث البروتينات. ومع ذلك ، وهذا يمكن أن يكون عملية الموارد طويلا جدا القول بأننا لا يكون ضروريا ، وخاصة إذا كان حجم العينة بدءا صغيرة و / أو محتوى س RNAو في exosomes منخفضة ، باعتبارها خطوات إضافية سيقلل بدرجة كبيرة من مواد أخرى. ومع ذلك ، مرة أخرى ، ينبغي أن يثبت طبيعة حويصلات معزولة عن وجود وعدم وجود بروتينات معينة. حتى الآن ، لم يتم التعرف على البروتين علامة فريدة من نوعها على الاطلاق لexosomes للتحقق من أن العينة تحتوي على exosomes ولا شيء آخر. ونتيجة لذلك ، يطلب من مزيج من الأساليب لتوصيف exosomes ، بما في ذلك تحديد حجم ومورفولوجية exosomes بواسطة المجهر الإلكتروني. أيضا ، يمكن تحديد نقاء العينة المجهر الإلكتروني ، لأن هذا الأسلوب يمكن أن تقدم لمحة عامة عن مستوى التلوث في العينة ، على سبيل المثال مع الحويصلات أكبر ، مثل المجهرية الدقيقة ، والهيئات أفكارك أو الحطام الخلية. وعلاوة على ذلك ، يمكن تحديد محتوى البروتين من exosomes بواسطة التدفق الخلوي وصمة عار الغربية ، والجمع بين هذه النتائج طريقتين في تحليل الغشاء ملزمة على السواء (على سبيل المثال وCD63CD81) والمنضوية البروتينات (مثل Tsg101 وأليكس) من exosomes. الكشف عن البروتينات في exosomes المخصب ، مثل Tsg101 ، CD63 وأليكس ، وعدم وجود البروتينات مثل بروتين calnexin شبكية هيولي باطني ، هو إشارة إلى أن بيليه exosome المخصب هو في الواقع وليس الحويصلات exosomes تلويث من المقصورات الأخرى في الخلية. ملف من الحمض النووي الريبي التي يتم الكشف عنها في exosomes يختلف اختلافا جذريا لتلك التي وجدت في الحمض النووي الريبي خلايا سليمة. وهكذا ، RNA exosomal تحليلها بواسطة Bioanalyzer أو في جل النهج المستندة إلى تحليل الحمض النووي الريبي تفتقر إلى قمم اثنان ل18S 28S الرنا الريباسي والمفارز ، والتي هي بارزة في تحليل الحمض النووي الريبي الخلوية. ولذلك فإننا نقول للكشف عن أي كميات كبيرة من الرنا الريباسي في عينة تشير إلى أن الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من أصل غير exosomal وحدها ، وبالتالي أن الأسلوب العزلة بحاجة إلى تحسين نوعية ومضمون.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> Exosome العزلة </td></tr><tr><td> أوبتيما L - 90K نابذة فائقة السرعة </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب نابذة فائقة السرعة السريعة الختم </td><td> بيكمان كولتر </td><td></td><td> اعتمادا على الدوار وهناك حاجة إلى الأنابيب المختلفة المستخدمة. Ti70 (342414) ، Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> سريع ختم أنبوب اللاسلكي توبر طقم </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur الحقنة تصفية ، 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> ويمكن أن تستخدم للسوائل اللزجة و / أو وحدات التخزين الكبيرة ، ونظام الترشيح فراغ ، 0.2 ميكرون ، من VWR الدولية بدلا من ذلك (514-0600). </td></tr><tr><td> الإلكترون المجهري </td></tr><tr><td> Formvar / الكربون شبكات النيكل المطلي </td><td> تيد بيلا المؤتمر الوطني العراقي </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD63 الإنسان </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 556019 </td><td> اضرب النهائي : 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotype السيطرة ؛ IgG1κ (MOPC 21) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M9269 </td><td> اضرب النهائي : 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> المضادة للماوس مفتش الذهب المتقارنة ، 10 نانومتر </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G7777 </td><td> اضرب النهائي : 1 ٪ </td></tr><tr><td> LEO 912AB أوميغا الكترون المجهر </td><td> كارل زايس NTS </td><td></td><td> أو معدات مماثلة. </td></tr><tr><td> التدفق الخلوي </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / كبريتات الخرز اللاتكس </td><td> بينية حيوية </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> الأجسام المضادة لطلاء من الخرز اللاتكس </td><td></td><td></td><td> على سبيل المثال لمكافحة CD63 من العلوم البيولوجية دينار بحريني (556019) </td></tr><tr><td> Intelli - RM - 2L خلاط </td><td> علمي </td><td></td><td> أو معدات مماثلة. </td></tr><tr><td> مفتش من مصل الإنسان </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> للكشف عن الأجسام المضادة </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td></td><td> على سبيل المثال : PE مكافحة CD63 (556020) PE مكافحة CD9 (555372) مراقبة Isotype PE مكافحة CD81 (555676) (555749) </td></tr><tr><td> FACSAria دينار بحريني </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td></td><td></td></tr><tr><td> لطخة ويسترن </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 درهم </td><td> إلما </td><td></td><td> أو معدات مماثلة. </td></tr><tr><td> عزل الحمض النووي الريبي وتحليل الحمض النووي الريبي exosomal </td></tr><tr><td> عزل الحمض النووي الريبي miRCURY كيت </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> اجيلنت 2100 Bioanalyzer </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

ميدان البحوث exosome تتوسع بسرعة ، مع زيادة كبيرة في منشورات في السنوات الأخيرة. وكانت أول من اقترح هذه الحويصلات الصغيرة (3-10 نانومتر) من أصل التقامي لتعمل كوسيلة لالشبكيات للقضاء على مستقبلات ترانسفيرين حين نضج الكريات الحمراء في 1 ، وكان اسمه في وقت لاحق exosomes. تتشكل Exosomes بواسطة الناشئين في وقت متأخر من الداخل الإندوسومات وانتاج الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) ، ويتم إطلاقها في البيئة من خلال الاندماج في MVBs مع غشاء البلازما 2. منذ اكتشاف أول exosomes ، وقد تبين أن مجموعة واسعة من الخلايا لإطلاق هذه الحويصلات. كما تم الكشف عن Exosomes في السوائل البيولوجية عدة ، بما في ذلك ، والبلازما اللعاب ، السائل غسل الأنف وحليب الثدي 3-6. وعلاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه مضمون وظيفة exosomes يعتمد على خلية المنشأ والشروط التي يتم إنتاجها. كما تم تطبيق مجموعة من الوظائف الشياطينtrated لexosomes ، مثل تحريض ضد الحساسية 7،8 التسامح ، والقضاء على الأورام التي أنشئت في الفئران 9 ، وتثبيط وتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية 10-12 ، وتعزيز التمايز في الخلايا التنظيمية تي 13 ، وتحفيز تكاثر الخلايا T 14 و استحثاث موت الخلايا المبرمج خلية T 15. عام 2007 أثبتنا أن exosomes سراحهم من الخلايا البدينة تحتوي على الحمض النووي الريبي رسول (مرنا) وmicroRNA (ميرنا) ، والتي يمكن أن تنقل من الحمض النووي الريبي من خلية واحدة إلى أخرى عبر exosomes. في الخلايا المتلقية ، وكان يظهر من خلال زيارات مكوكية مرنا exosomes إلى أن تترجم إلى بروتين ، مما يشير إلى وظيفة تنظيمية لنقل الحمض النووي الريبي 16. علاوة على ذلك ، لقد أظهرنا أيضا أن exosomes المستمدة من الخلايا التي تزرع تحت الاكسدة يمكن أن تحدث المزيد من الضغوط ضد التسامح في الخلايا المتلقية ، وبالتالي تشير إلى الوظيفة البيولوجية للمكوك exosomal RNA 17. وسائل الإعلام والثقافة الخلية البيولوجية المشترك السوائلntain خليط من الحويصلات ويسفك شظايا. عزلة ذات جودة عالية طريقة لexosomes ، تليها توصيف وتحديد exosomes ومحتواها ، وبالتالي حاسما للتمييز exosomes من الحويصلات الأخرى ، والجسيمات. هنا ، نقدم طريقة لعزل الخلايا من كلا exosomes المتوسطة الثقافة وسوائل الجسم. ويستند هذا الأسلوب عزلة على الطرد المركزي وكرر خطوات الترشيح ، وتليها خطوة تنبيذ فائق النهائي الذي exosomes هي مكعبات. وأبرزت وسائل مهمة لتحديد وتوصيف exosomes مورفولوجية exosomal ومحتوى البروتين ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، والتدفق الخلوي لطخة غربية. وتستند عملية تنقية من الحمض النووي الريبي لexosomal اللوني الكامل على عمود الدوران ويتم تحليل الحمض النووي الريبي exosomal العائد وحجم التوزيع باستخدام Bioanalyzer.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

هذه الورقة يوضح طرق لتنقية والعزلة وكشف exosomes ، فضلا عن تقنيات لتحليل محتواها الجزيئية. هذه الأساليب قابلة للتكيف لعزل exosome من كل وسائل الإعلام والثقافة الخلية السوائل البيولوجية ، ويمكن أن يتجاوز تحليل المحتوى الجزيئية يكون من المفيد أيضا في الدراسات الفنية.

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Research

JoVE Journal

Biology

99.1K Views.  University of Gothenburg. هذه الورقة يوضح طرق لتنقية والعزلة وكشف exosomes ، فضلا عن تقنيات لتحليل محتواها الجزيئية. هذه الأساليب قابلة للتكيف لعزل exosome من كل وسائل الإعلام والثقافة الخلية السوائل البيولوجية ، ويمكن أن يتجاوز تحليل المحتوى الجزيئية يكون من المفيد أيضا في الدراسات الفنية.

Video: Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

العزلة وتوصيف هويشت منخفضة CD45 السلبية ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

عزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم في البكتيريا الزرقاء

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential biotechnology models. Recent work has demonstrated that both marine and freshwater cyanobacteria produce extracellular vesicles -&#160;small membrane-bound structures released from the outer surface of the microbes. While vesicles likely contribute to diverse biological processes, their specific functional roles in cyanobacterial biology remain largely unknown. To encourage and advance research in this area, a detailed protocol is presented for isolating, concentrating, and purifying cyanobacterial extracellular vesicles. The current work discusses methodologies that have successfully isolated vesicles from large cultures of Prochlorococcus, Synechococcus, and Synechocystis. Methods for quantifying and characterizing vesicle samples from these strains are presented. Approaches for isolating vesicles from aquatic field samples are also described. Finally, typical challenges encountered with cyanobacterial vesicle purification, methodological considerations for different downstream applications, and the trade-offs between approaches are also discussed.

The present protocol providesdetailed descriptions for isolation, concentration,and characterization of extracellular vesicles from cyanobacterial cultures. Approaches for purifying vesicles from cultures at different scales, trade-offs among methodologies, and considerations for working with field samples are also discussed.

عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can indirectly shape brain function. At the interface between the brain and the systemic circulation, the choroid plexuses (CP), which constitute the blood-cerebrospinal fluid barrier, have been highlighted as a key site of periphery-to-brain communication. CP produce the cerebrospinal fluid, neurotrophic factors, and signaling molecules that can shape brain homeostasis. CP are also an active immunological niche. In contrast to the brain parenchyma, which is populated mainly by microglia under physiological conditions, the heterogeneity of CP immune cells recapitulates the diversity found in other peripheral organs. The CP immune cell diversity and activity change with aging, stress, and disease and modulate the activity of the CP epithelium, thereby indirectly shaping brain function. The goal of this protocol is to isolate murine CP and identify about 90% of the main immune subsets that populate them. This method is a tool to characterize CP immune cells and understand their function in orchestrating periphery-to-brain communication. The proposed protocol may help decipher how CP immune cells indirectly modulate brain function in health and across various disease conditions.

This study uses flow cytometry and two different gating strategies on isolated perfused mice brain choroid plexuses; this protocol identifies the main immune cell subsets that populate this brain structure.

عزل وتوصيف الخلايا المناعية من الضفائر المشيمية للفئران المجهرية

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...