그것은 시안 균에 익숙하지 않은 사람들이 쉽게 phycobilisome를 분리 할 수 있도록 간단하고 빠른 프로토콜입니다. 이 기술의 장점은 작은 규모에 적응하고 수행하기 쉽다는 것입니다. 모델 및 비모델 시노박테리아의 피코빌리좀을 그대로 분리하는 간단하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 방법입니다.
먼저 750나노미터에서 0.8OD의 세포 배양을 1리터 플라스크로 전송하여 B-HEPES 배지 의 500밀리리터로 희석하여 750나노미터에서 0.2의 OD를 달성한다. OD가 0.8에서 1에 도달할 때까지 일정한 교반으로 문화를 성장하여 후기 기하급수적 성장 단계를 나타냅니다. 원심 분리는 실온에서 20 분 동안 10, 000 배 g의 속도로 문화를 원심분리하고 상체를 폐기합니다.
세포 펠릿을 일시 중단하고 0.75 대구칼륨 인산염 완충제, pH 7로 두 번 세척한다. 실온에서 원심화로 50 밀리리터 원심분리기 튜브의 세포를 펠렛. 상체를 버리고 0.75 개의 어금니 칼륨 인산염 버퍼로 세포를 다시 중단하십시오.
전자 균형에 의해 펠릿의 젖은 무게를 측정하고 완충제의 5 밀리리터에서 펠릿의 1 그램 젖은 무게를 다시 중단합니다. 셀 서스펜션 1밀리리터와 0.4~0.6그램의 0.1 밀리미터 유리 구슬을 2밀리리터 스크류 캡 바이알에 넣습니다. 비드 비터에 의해 30 초 동안 셀을 끊습니다.
실내 온수 욕조에서 2분간 튜브를 식힙니다. 용해 후, 500 배 g의 속도로 실온에서 10 초 동안 유리병을 원심 분리합니다. 파이펫으로 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 수집합니다.
구슬은 0.75의 0.75 개의 어금니 칼륨 인산염 버퍼로 한 번 씻은 다음 동일한 원심 분리 튜브로 옮겨냅니다. 트리톤 X-100을 용액 이면에 트리톤 X-100을 추가하고 실온에서 흔들 셰이커에 인큐베이션하고 20분 동안 40 RPM을 배양합니다. 17, 210배g에서 20분 동안 튜브를 원심분리하고 상온에서 상부 트리톤 미셀 층없이 상류층을 최대 1시간 동안 보관합니다.
pH 7에서 0.75 의 어금강 칼륨 인산염 완충제에서 4개의 자당 농도를 만듭니다. 40 밀리리터 원심분리기 튜브 의 바닥에 두 개의 어금니 자당 버퍼2.8 밀리리터를 놓고 3 층의 자당 솔루션으로 오버레이하십시오. 마지막으로, 생성된 그라데이션을 통해 상체 분획을 포함하는 PBS 3밀리리터를 추가하고 원심분리기를 추가합니다.
초환화시, 분획된 PBS와 물리코빌리단백질을 층 사이에 응축시키고 Syn6803 및 인터페이스에서 파란색 밴드를 관찰한다. 0.75 대구칼륨 인산염 완충제와 막원심 필터 단위로 분획을 반복적으로 집중하고 희석시켜 자당을 제거한다. PBS 형광을 측정하기 위해 농축 된 PBS 샘플을 0.75 개의 어금니 칼륨 인산염 버퍼로 희석하여 최대 500 마이크로 리터 부피를 구성합니다.
희석된 PBS 샘플을 투명 유리 튜브에 추가하고 완전히 동결될 때까지 액체 질소로 튜브를 고정시하십시오. 냉동 튜브를 액체 질소로 미리 채워진 투명 한 분해 용기로 이동합니다. 완전한 셀 용해는 중도화 전에 상골과 짙은 파란색 녹색 색상을 보여줍니다.
격리된 PBS의 자당 밀도 그라데이션 분리는 해리된 물리코빌리단백질의 여러 분획을 나타내며 가장 낮은 분획은 그대로 PBS를 나타낸다. JSC 1 과 Syn6803의 해리 및 그대로 PBS로부터의 흡수 스펙트럼은 622 나노미터에서 동일한 피크를 가지며, 이는 피코시아닌에 해당한다. 더욱이, JSC-1의 해리 및 온전한 PBS 모두에서 571 나노미터에서 물리에리스린 흡수 피크.
해리된 PBS의 방출 스펙트럼은 Phycocyanin에서 방출을 나타내는 Syn6803 및 JSC-1에서 약 650 나노미터에서 1개의 강한 피크를 가지고 있습니다. 651나노미터 및 684나노미터의 형광 방출 최대 피크는 피코시아닌에 의해 수확된 에너지가 ApcD 및 ApcE인 알로피코시아니안 및 말단 방출기로 효율적으로 전달되었다는 것을 보여줍니다. 이 수치는 자외선 조사 하에 아연 스테인드 SDS-PAGE를 나타내며, 여기서 phycobiliprotein 하위 단위는 강하게 형광이고 ApcE는 화살로 표시된 약한 형광을 보였다.
쿠마시 블루 스테닝은 상부 분획이 다른 비PBS 용해성 단백질을 포함하고 그대로 PBS와 Syn6803은 화살로 표시된 저명한 ApcE 밴드를 나타내며, 해리된 PBS 분획이 부족하다는 것을 보여준다. 초원심분리는 1:3의 비율로 제조된 자당 그라데이션이 1:10의 비율로 만들어진 그라데이션보다 더 넓은 밴드를 표시한다는 것을 보여줍니다. 세포와 솔보리시스를 완전히 통해 더 많은 물리코빌리좀을 얻는 것이 중요합니다.
저온-EM 또는 혼합 분광법과 같은 다른 방법은 피코빌리좀의 단백질 구조 또는 단백질 조성을 연구하는 데 사용될 수 있다.
