بروتوكول قائم على التشريح المجهري بالليزر لتحليل LC-MS / MS للملف البروتيني لحبيبات الميلانين العصبية

يسمح مزيجنا من التشريح الدقيق بالليزر وقياس الطيف الكتلي بالتحقيق في التغيرات التي تم حلها مكانيا على مستوى البروتين في أي نوع من الأنسجة. في حالتنا ، حبيبات الميلانين العصبية. يسمح بروتوكولنا بالتحليل البروتيني بناء على مواد عينة محدودة.

وهو عادة ما يمثل تحديا كبيرا عند العمل مع أنسجة المخ بعد الوفاة. حيث يمكن عزل الخلايا المفردة لمقارنة الحالات الصحية والمرضية على مستوى البروتين. هذا قد يعزز فهمنا لآليات المرض.

للبدء ، ضع شريحة غشاء الأنسجة في حامل الشريحة على مرحلة الروبوت بحيث يكون المنديل متجها لأعلى. للحصول على مسح عام لقسم الأنسجة. استخدم وظيفة المسح الضوئي ، وحدد منطقة الاهتمام من أعلى اليسار والزوايا اليمنى السفلية.

ثم حدد فحص جميع عائد الاستثمار لإجراء الفحص. للاختيار التلقائي لحبيبات الميلانين العصبية في مجال الرؤية الحالي. حدد تحليل مجال الرؤية.

ثم حدد عكس النتيجة ، واضبط عتبة قنوات RGB. بحيث يتم تمييز حبيبات الميلانين العصبية فقط باللون الأحمر في نافذة المعاينة. انقر الآن على حسنا ، لاستخدام الإعدادات المعدلة لمجال الرؤية.

اضبط إعدادات الليزر باستخدام منطقة من الشريحة مغطاة بالغشاء فقط. املأ غطاء أنبوب جمع العينات ب 50 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. وأدخل الغطاء في جامع المحرك الروبوتي.

باستخدام واجهة البرنامج ، ضع المحرك الآلي فوق المرحلة الثانية من الروبوت لبدء جمع العينات. ابدأ تشغيل الليزر. تحكم في إعدادات الطاقة والتركيز أثناء عملية الليزر واضبط الإعدادات إذا لزم الأمر.

تأكد من العزل المناسب والقذف للكائنات المعزولة في غطاء أنبوب جمع العينات لأول 10 كائنات على الأقل. عند اكتمال أخذ العينات ، انتقل إلى المحرك الآلي إلى موضع البداية وقم بإزالة أنبوب جمع العينات. بعد تدوير العينات عن طريق التمركز.

جفف العينات لمدة 1.5 ساعة في مكثف فراغ. بعد إجراء الهضم الثلاثي كما هو موضح في النص. تحضير العينة لتحليل HPLC-MS عن طريق إذابة 200 إلى 400 نانوجرام من عينة الببتيدات في حجم محدد من 0.1٪ TFA.

في مداخل قارورة الزجاج الطيفي الكتلة الخاملة. إذا كان تحديد التركيز غير قابل للتطبيق بسبب انخفاض كمية العينة. تحقق من تحميل العينة المتطابقة من خلال مقارنة إجمالي التيار الأيوني.

لبدء تحليل البيانات الخام البروتينية. انقر فوق تحميل لتحميل الملفات الأولية في البرنامج. انقر على تعيين التجربة لتعيين أسماء العينات.

لتحديد معلمات خاصة بالمجموعة. أضف التعديلات عن طريق اختيار deamidation NQ والأكسدة M و carbamidomethylation N-term كتعديلات متغيرة. ثم أضف كارباميدوميثيل C كتعديل ثابت.

اختر التربسين كإنزيم هضم في علامة تبويب الهضم. في علامة التبويب القياس الكمي المجاني للتسمية ، أضف الخيار LFQ وإذا كان سيتم معالجة أكثر من 10 ملفات ، فاختر خيار LFQ السريع لتقصير وقت المعالجة. التأكد من بقاء جميع المعلمات الأخرى الخاصة بالمجموعة في إعدادات المصنع.

انتقل إلى علامة التبويب المعلمات العامة ، وأضف ملف FASTA المشتق من uniprot. org في علامة التبويب التسلسلات. عدل قاعدة المعرف وفقا لذلك.

وأضف معرف التصنيف 9606 للإنسان العاقل. لتحديد كمية البروتين اختيار الببتيدات الفريدة والحلاقة. ثم أضف خيار iBAQ كمقياس لقياس كمية البروتين في علامة التبويب القياس الكمي الخالي من التسمية.

تأكد من بقاء جميع المعلمات العامة الأخرى في إعدادات المصنع وانقر فوق ابدأ. بعد إجراء التحليل بنجاح ، قم باسترداد مجموعات البروتين. إخراج TXT.

قم بتحميل مجموعات البروتين. txt في برنامج التحليل. أضف قيم iBAQ كأعمدة رئيسية وقم بفرز جميع الأعمدة الأخرى وفقا لنوعها.

قم بتصفية الأفخاخ والملوثات عن طريق تصفية الصفوف بناء على العمود الفئوي وتصفية النتائج بناء على القيم الصالحة. تصدير الإخراج بتنسيق txt لمزيد من المعالجة. وتقييم النتائج فيما يتعلق بسؤال البحث.

في الدراسة الحالية ، تم تحديد 1،898 مجموعة بروتينية في NMGs وتم تحديد 1،565 في أنسجة SN المحيطة ، تم تحديد 1،384 منها في كلا منطقتي الأنسجة. وهكذا تم تحديد 514 و 181 مجموعة بروتين حصريا في أنسجة NMGs و SN على التوالي. في قياسات DDA التمثيلية.

تشير قيم iBAQ الأعلى قليلا في NMGs مقارنة ب SN إلى وفرة أعلى من بروتين السيتوبلازم dynien-1 ، السلسلة الثقيلة 1 في NMGs. يمكن التحقق من هذه الملاحظة في تجارب PRM للببتيد ESPEVLLTLDILK. حيث تم الكشف عن وفرة أعلى في NMGs.

استنادا إلى منطقة الذروة على مستوى MS1 و MS2. الخطوة الأكثر أهمية هي إلى حد بعيد عزل NMGs ، حيث يعتمد باقي البروتوكول على هذه الخطوة ليتم تنفيذها بشكل صحيح. بعد إجراء LMD ، يمكن استخدام العينات ومعالجتها لأي نوع من تقنيات omics مثل علم الجينوم أو النسخ أو البروتينات أو الدهون.