뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜

레이저 미세 해부와 질량 분석법의 조합은 모든 종류의 조직에서 단백질체 수준에서 공간적으로 분해된 변화를 조사할 수 있습니다. 우리의 경우, 신경 멜라닌 과립. 당사의 프로토콜은 제한된 샘플 물질을 기반으로 단백질체학 분석을 허용합니다.

이는 일반적으로 사후 뇌 조직으로 작업할 때 큰 도전입니다. 단일 세포를 분리하여 단백질체 수준에서 건강한 상태와 질병 상태를 비교할 수 있기 때문입니다. 이것은 질병 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

시작하려면 조직이 위쪽을 향하도록 로보 스테이지의 슬라이드 홀더에 조직막 슬라이드를 놓습니다. 조직 섹션의 개요 스캔을 획득합니다. 스캔 기능을 사용하여 왼쪽 상단과 오른쪽 하단에서 관심 영역을 선택하십시오.

그런 다음 모든 ROI 검색을 선택하여 스캔을 수행합니다. 현재 시야에서 신경 멜라닌 과립의 자동 선택. 시야 분석을 선택합니다.

그런 다음 결과 반전을 선택하고 RGB 채널의 임계값을 설정합니다. 따라서 뉴로멜라닌 과립만 미리보기 창에서 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이제 확인을 클릭하여 시야에 대해 조정 된 설정을 사용하십시오.

멤브레인으로 덮인 슬라이드 영역만 사용하여 레이저 설정을 조정합니다. 샘플 수집 튜브 캡을 50마이크로리터의 초순수로 채웁니다. 그리고 로보 발동기의 수집기에 캡을 삽입하십시오.

소프트웨어 인터페이스를 사용하여 로보 무버를 로보 스테이지 2 위에 배치하여 샘플 수집을 시작합니다. 레이저를 시작하십시오. 레이저 공정 중에 에너지 및 초점 설정을 제어하고 필요한 경우 설정을 조정합니다.

격리된 물체를 최소한 처음 10개의 물체에 대해 샘플 수집 튜브 캡으로 적절하게 분리하고 투석하도록 합니다. 샘플링이 완료되면 로보 무버를 시작 위치로 탐색하고 샘플 수집 튜브를 제거합니다. 샘플을 회전시킨 후 중심화시킨다.

진공 농축기에서 1.5 시간 동안 샘플을 건조시킵니다. 본문에 설명 된대로 삼중 소화를 수행 한 후. HPLC-MS 분석을 위해 200 내지 400 나노그램의 샘플 펩티드를 0.1%TFA의 정의된 부피에 용해시켜 샘플을 준비합니다.

불활성 질량 분석 유리 바이알 입구에서. 낮은 샘플 양으로 인해 농도 측정이 적용되지 않는 경우. 총 이온 전류를 비교하여 동일한 샘플 로딩을 확인합니다.

단백질체학 원시 데이터 분석을 시작합니다. 로드를 클릭하여 원시 파일을 소프트웨어로 로드합니다. 실험 설정을 클릭하여 샘플 이름을 할당합니다.

그룹별 매개 변수를 정의합니다. 탈아미드화 NQ, 산화 M 및 카바미도메틸화 N-항을 가변 수정으로 선택하여 수정을 추가합니다. 그런 다음 카바미도메틸화 C를 고정 변형으로 추가합니다.

소화 탭에서 트립신을 소화 효소로 선택하십시오. 레이블 없는 정량화 탭에서 LFQ 옵션을 추가하고 10개 이상의 파일을 처리해야 하는 경우 빠른 LFQ 옵션을 선택하여 처리 시간을 단축합니다. 다른 모든 그룹별 매개변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인합니다.

전역 매개 변수 탭으로 이동하여 uniprot에서 파생된 FASTA 파일을 추가합니다. 시퀀스 탭의 조직. 식별자 규칙을 적절하게 수정합니다.

그리고 호모 사피엔스에 대한 분류 ID 9606을 추가하십시오. 단백질 정량화를 위해서는 독특한 면도기 펩타이드를 선택하십시오. 그런 다음 iBAQ 옵션을 무라벨 정량화 탭에서 단백질 정량화를 위한 측정값으로 추가합니다.

다른 모든 전역 매개 변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인하고 시작을 클릭하십시오. 분석이 성공적으로 수행된 후 단백질 그룹을 회수한다. txt 출력.

단백질 그룹을 로드합니다. TXT 파일을 사용할 수 있습니다. iBAQ 값을 기본 열로 추가하고 유형에 따라 다른 모든 열을 정렬합니다.

범주형 열을 기준으로 행을 필터링하여 미끼와 오염 물질을 필터링하고 유효한 값을 기준으로 결과를 필터링합니다. 추가 처리를 위해 출력을 txt 형식으로 내보냅니다. 그리고 연구 질문에 관한 결과를 평가하십시오.

본 연구에서, NMG에서 1, 898 개의 단백질 그룹이 확인되었고, 주변 SN 조직에서 1, 565 개가 확인되었으며, 그 중 1, 384 개가 두 조직 영역에서 확인되었다. 따라서 514 및 181 단백질 그룹은 각각 NMG 및 SN 조직에서 독점적으로 확인되었습니다. 대표적인 DDA 측정에서.

SN에 비해 NMGs에서 약간 더 높은 iBAQ 값은 NMGs에서 단백질 세포질 dynien-1, 중쇄 1의 더 높은 풍부함을 나타냅니다. 이러한 관찰은 펩티드 ESPEVLLTLDILK에 대한 PRM 실험에서 검증될 수 있었다. NMG에서 더 높은 존재가 감지되었습니다.

MS1 및 MS2 수준의 피크 영역을 기반으로 합니다. 가장 중요한 단계는 NMG의 격리이며, 나머지 프로토콜은 이 단계를 기반으로 제대로 수행됩니다. LMD 절차 후 샘플을 활용하고 유전체학, 전사체학, 단백질체학 또는 지질체학과 같은 모든 종류의 오믹스 기술에 대해 추가 처리할 수 있습니다.