פרוטוקול מבוסס מיקרודיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין

השילוב שלנו של מיקרו-דיסקציה בלייזר וספקטרומטריית מסה מאפשר לחקור שינויים שנפתרו מרחבית ברמה הפרוטאומית בכל סוג של רקמה. במקרה שלנו, גרגירי נוירומלנין. הפרוטוקול שלנו מאפשר ניתוח פרוטאומי המבוסס על חומר מדגם מוגבל.

וזה בדרך כלל אתגר גדול בעבודה עם רקמת מוח לאחר המוות. מכיוון שניתן לבודד תאים בודדים כדי להשוות בין מצבים בריאים למחלות ברמה הפרוטאומית. זה עשוי לשפר את ההבנה שלנו לגבי מנגנוני מחלה.

כדי להתחיל, הנח את שקופית קרום הרקמה במחזיק השקופיות על שלב הרובו כאשר הרקמה פונה כלפי מעלה. כדי לרכוש סריקת סקירה כללית של סעיף הרקמות. השתמש בפונקציית הסריקה, בחר את אזור העניין מהפינה השמאלית העליונה ומהפינה הימנית התחתונה.

לאחר מכן בחר סרוק את כל ה- ROIs כדי לבצע את הסריקה. עבור הבחירה האוטומטית של גרגירי נוירומלנין בשדה הראייה הנוכחי. בחר ניתוח שדה תצוגה.

לאחר מכן בחרו באפשרות 'הפוך תוצאה' וקבעו את הסף לערוצי RGB. כך שרק גרגירי נוירומלנין מודגשים באדום בחלון התצוגה המקדימה. עכשיו לחץ על בסדר, כדי להשתמש בהגדרות המותאמות לשדה הראייה.

התאם את הגדרות הלייזר באמצעות אזור בשקופית המכוסה על-ידי הממברנה בלבד. מלא את מכסה צינור איסוף הדגימה ב -50 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים. והכניסו את הכובע לאספן של הרובו.

באמצעות ממשק התוכנה, מקם את ה-robo mover מעל שלב הרובו השני כדי להתחיל באיסוף הדגימות. הפעל את הלייזר. שלוט בהגדרות האנרגיה והמיקוד במהלך תהליך הלייזר והתאם את ההגדרות במידת הצורך.

הקפידו על בידוד וקטפולטציה נאותים של החפצים המבודדים לתוך מכסה צינור איסוף הדגימות עבור לפחות 10 האובייקטים הראשונים. לאחר השלמת הדגימה, נווט את ה- robo mover למיקום ההתחלה שלו והסר את צינור איסוף הדגימה. לאחר סיבוב הדגימות על ידי צנטרציה.

יבשו את הדגימות במשך שעה וחצי ברכז ואקום. לאחר ביצוע עיכול טריפטי כמתואר בטקסט. הכן את הדגימה לניתוח HPLC-MS על ידי המסת 200 עד 400 ננוגרם של פפטידי דגימה בנפח מוגדר של 0.1% TFA.

בפתחי בקבוקוני זכוכית ספקטרומטריים בעלי מסה אינרטית. אם קביעת הריכוז אינה ישימה בשל כמות מדגם נמוכה. ודא טעינת דגימה זהה על-ידי השוואת זרם היונים הכולל.

כדי להתחיל בניתוח נתונים גולמיים פרוטאומיים. לחץ על טען לטעינת הקבצים הגולמיים לתוכנה. לחץ על סט ניסוי כדי להקצות את שמות הדוגמאות.

כדי להגדיר פרמטרים ספציפיים לקבוצה. הוסף את השינויים על ידי בחירה ב-NQ, חמצון M וקרבמידומתילציה N-term כשינויים משתנים. ולאחר מכן להוסיף קרבמידומתילציה C כשינוי קבוע.

בחר טריפסין כאנזים עיכול בכרטיסיית העיכול. בכרטיסייה כימות ללא תוויות, הוסף את האפשרות LFQ ואם יש לעבד יותר מ -10 קבצים, בחר באפשרות LFQ מהירה כדי לקצר את זמן העיבוד. הבטחה שכל שאר הפרמטרים הספציפיים לקבוצה יישארו בהגדרות היצרן.

המשך לכרטיסייה פרמטרים כלליים והוסף את קובץ FASTA הנגזר מ- uniprot. בכרטיסייה רצפים. שנה את כלל המזהה בהתאם.

והוסף את מזהה הטקסונומיה 9606 עבור הומו ספיינס. לכימות חלבונים בחרו פפטידים ייחודיים וסכיני גילוח. לאחר מכן הוסף את אפשרות iBAQ כמדד לכימות חלבונים בכרטיסיית הכימות ללא תוויות.

ודא שכל שאר הפרמטרים הגלובליים נשארים בהגדרות היצרן ולחץ על התחל. לאחר שהניתוח בוצע בהצלחה לאחזר את קבוצות החלבון. פלט txt.

טען את קבוצות החלבון. קובץ txt בתוכנת הניתוח. הוסף את ערכי iBAQ כעמודות ראשיות ומיין את כל העמודות האחרות לפי סוגן.

סנן פיתיונות ומזהמים על-ידי סינון שורות בהתבסס על העמודה הקטגוריאלית וסינון תוצאות בהתבסס על ערכים חוקיים. ייצא את הפלט בפורמט txt לעיבוד נוסף. ולהעריך את התוצאות לגבי שאלת המחקר.

במחקר הנוכחי, 1, 898 קבוצות חלבונים זוהו ב- NMGs ו- 1, 565 זוהו ברקמת SN שמסביב מתוכם 1, 384 זוהו בשני אזורי הרקמות. לפיכך 514 ו -181 קבוצות חלבונים זוהו באופן בלעדי ברקמות NMG ו- SN בהתאמה. במדידות DDA המייצגות.

ערכי iBAQ מעט גבוהים יותר ב- NMGs בהשוואה ל- SN הצביעו על שפע גבוה יותר של החלבון cytoplasmic dynien-1, שרשרת כבדה 1 ב- NMGs. תצפית זו יכולה להיות מאומתת בניסויי PRM עבור הפפטיד ESPEVLLTLDILK. שבו זוהה שפע גבוה יותר ב- NMGs.

מבוסס על אזור השיא ברמת MS1 ו- MS2. הצעד החשוב ביותר הוא ללא ספק בידוד של NMGs, כמו שאר הפרוטוקול מבוסס על שלב זה כדי להתבצע כראוי. לאחר הליך LMD, ניתן להשתמש בדגימות ובתהליך נוסף עבור כל סוג של טכניקת אומיקה כגון גנומיקה, תעתיק, פרוטאומיקה או ליפידומטיקה.