في جنين ذبابة الفاكهة المبكر ، تخضع العديد من العضيات لحركة واسعة النطاق. يصف بروتوكولنا كيفية مراقبة هذه الحركة باستخدام أصباغ الفلورسنت المطورة لزراعة الخلايا. بالمقارنة مع البروتينات الفلورية ، فإن مجسات الفلورسنت المتاحة تجاريا أكثر إشراقا وتمتد على نطاق أوسع من الطيف.
فهي تسمح بوضع العلامات المشتركة متعددة الإرسال ويمكن استخدامها في أي خلفية وراثية. يستغرق الأمر ممارسة وتجربة وخطأ لمعرفة كم من الوقت لتجفيف الأجنة ، بحيث تنفجر أثناء الحقن أو تجف وتتوقف عن التطور. للبدء ، ابدأ في تحضير إبر الحقن عن طريق وضع الشعيرات الدموية في حامل شعري على مجتذب الإبرة وتأمينه باستخدام مكسرات الجناح.
محاذاة مركز الشعيرات الدموية مع عنصر التسخين. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، اختر الإعدادات المناسبة على مجتذب الإبرة. باستخدام مجهر تشريح ، قم بإجراء اختبار مراقبة الجودة.
اضغط على الإبر في المعجون أفقيا مع تعليق أطراف الإبرة في الهواء. غطي الإبر بالغطاء وخزنيها حتى الاستخدام. باستخدام أطراف تحميل الإبرة المرفقة بماصة دقيقة ، ارسم ميكرولتر واحد من محلول الحقن في الطرف دون حبس فقاعات الهواء.
باستخدام القفازات ، أمسك الإبرة بيد واحدة مع توجيه طرفها بعيدا وأدخل طرف التحميل فيها. قم بتوزيع السائل بالقرب من طرف الإبرة ، وقم بإزالة الماصة وأمسك الإبرة عموديا حتى يتدفق السائل إلى الطرف. قم بتغطية الحاوية بورق الألومنيوم دون إتلاف أطراف الإبرة لمنع تبييض الأصباغ.
باستخدام ماصة نقل ، أو ماصة صغيرة ، ضع قطرة صغيرة من غراء السباتان في وسط زلة غطاء مستطيلة ، واتركها تتبخر. لإزالة المشيمة ميكانيكيا ، قم بتغطية صفيحة الجنين المسنة بشكل مناسب بطبقة رقيقة من زيت الهالوكربون 27 لتحويل قشر البيض شفافا. عرض اللوحة تحت مجهر تشريح مع إضاءة عابرة لتأكيد مرحلة الجنين وتحديد الأجنة في مراحل الانقسام.
باستخدام ملاقط دقيقة ، التقط جنينا من المرحلة المطلوبة عن طريق الاستيلاء على الزوائد الظهرية ونقلها إلى الشريحة الزجاجية المعدة المغطاة بشريط على الوجهين. ضع الجنين على الشريط وقلل من نقل الزيت. لف الجنين بلطف عبر سطح الشريط عن طريق الدفع بجانب طرف الملقط دون دسه مباشرة.
استمر في لف الجنين حتى تلتصق المشيمية بالشريط وتتشقق. بعد تشققات المشيمة ، استمر في لف الجنين لفصله عن الكوريون ، الذي لا يزال عالقا بالشريط. لف الجنين مرة أخرى على الوتر ، وهو أقل لاصقة من الشريط.
افركي الجنين بلطف باستخدام الملقط حتى يعلق على الملقط لنقله. ثم ، انقل الجنين إلى زلة الغطاء واجعله على اتصال بالغراء لتثبيت الجنين في مكانه ، وفصله عن الملقط. اضبط اتجاه الجنين على قسيمة الغطاء.
دع الأجنة تجف لمدة خمس إلى 12 دقيقة عن طريق وضع الغطاء مع الأجنة في غرفة التجفيف وختمها. اخلع الغطاء من الغرفة وضع قطرة من زيت الهالوكربون 700 ، تغطي الأجنة لمنع المزيد من الجفاف. فحصها تحت نطاق التشريح والمضي قدما في الحقن المجهري إذا تم تجفيف الأجنة بشكل صحيح.
ضع هدف 4X في مسار الضوء وباستخدام مقبض التركيز البؤري على المجهر ، اضبط الأجنة في التركيز. حرك الأجنة أفقيا إلى مركز مجال الرؤية باستخدام عناصر التحكم في المرحلة. حافظ على الأجنة على حافة مجال الرؤية وقم بتحريكها استعدادا لخفض الإبرة.
البقاء مع نفس المستوى البؤري ، وخفض طرف الإبرة والتأكد من أنها مرئية في مجال الرؤية جنبا إلى جنب مع الأجنة. تحقق من أن الإبرة تعمل عن طريق توزيع بعض محلول الحقن في زيت الهالوكربون 700. إذا نجحت ، فستظهر فقاعة من المحلول في الزيت بالقرب من طرف الإبرة.
باستخدام عناصر التحكم في المرحلة ، حرك الجنين نحو طرف الإبرة حتى يثقب الطرف الجنين بلطف ويدخل فيه. في الوقت نفسه ، ابدأ تدفق محلول الحقن حتى تظهر بقعة واضحة عابرة في موقع طرف الإبرة ، مما يشير إلى نقل المحلول بنجاح إلى الجنين. قم بتأمين انزلاق الغطاء على المجهر البؤري باستخدام حامل الشريحة.
توخ الحذر لأن الغطاء هش. افحص الأجنة باستخدام وظيفة التألق على المجهر البؤري بهدف 40X وتأكد من أن الفلورو 4 في الجنين مرئي قبل المتابعة. بالنسبة للتصوير المباشر، خلال المراحل المتزامنة، اضبط حجم الصورة على 512 × 512 بكسل، ومتوسط الخط من ثلاثة، ومعدل إطارات قدره 0.1 إطار في الثانية.
بعد حقن صبغة BODIPY 493 503 ، تم توطينها في الموقع الذي تم فيه إدخال طرف الإبرة ثم نشرها بجوار موقع الحقن. بعد 24 دقيقة ، انتشرت الصبغة بعد نقطة منتصف الجنين. تمت مراقبة حركة العضية عن طريق حقن الجنين ب BODIPY 493 503 و LysoTracker Red.
كشف تحليل قياس سرعة صورة الجسيمات أن المحتويات الجنينية تقاربت في المنطقة الوسطى من الجنين ، حيث يتدفق السيتوبلازم إلى داخل الجنين. يوفر وضع العلامات على ER ، باستخدام ER-Tracker Green ، دقة حية للغلاف النووي ، مما يسمح بتصور مراحل دورة الخلية الرئيسية. تم حقن الجنين ب MitoView 633 في مرحلة الأديم الأرومي وتم تصويره بعد أربع ساعات.
تظهر الصورة خلية عصبية جلدية لجنين في امتداد الفرقة الجرثومية. تم حقن جنين خلوي بمزيج من BODIPY 493 503 و SiR Tubulin ، مما يدل على أن قطرات الدهون تتحرك في اتجاهين على طول الأنابيب الدقيقة. يجب تجفيف الجنين جزئيا بحيث يمكن حقن السائل.
سيؤدي الجفاف القليل جدا إلى تسرب الجنين عند حقنه ، والكثير من الجفاف سيقتل الجنين. يمكن وصف مقاطع الفيديو للعضيات المتحركة عبر تقنيات تحليل الصور المتنوعة. يكشف تتبع الجسيمات عن سلوك العضيات الفردية ، ويكشف قياس سرعة تصوير الجسيمات عن التدفق السائب.
