ショウジョウバエの初期胚では、多くの細胞小器官が大規模な運動を受ける。私たちのプロトコルは、細胞培養用に開発された蛍光色素を使用してこの動きを監視する方法を説明しています。蛍光タンパク質と比較して、市販の蛍光プローブはより明るく、より広い範囲のスペクトルにまたがる。
それらは多重コラベリングを可能にし、任意の遺伝的背景で使用することができる。胚を乾燥させるのにどれくらいの時間がかかるかを知るには、注射中に破裂するか、乾燥して発達を止めるかを知るために練習と試行錯誤が必要です。まず、ニードルプーラーのキャピラリーホルダーにキャピラリーを入れ、ウィングナットを使用して固定して、注射針の準備を開始します。
キャピラリーの中心を発熱体に合わせます。製造元の指示に従って、ニードルプーラーの適切な設定を選択します。解剖顕微鏡を用いて、精度管理試験を行う。
針先を空中に吊り下げた状態で、針をパテに水平に押し込みます。針を蓋で覆い、使用時まで保管してください。マイクロピペットに取り付けられたニードルローディングチップを使用して、気泡を捕捉することなく、1マイクロリットルの注射液をチップに引き込む。
手袋を使用して、先端を遠ざけた状態で針を片手で持ち、ローディングチップを挿入します。針先の近くに液体を分配し、ピペットを取り出し、液体が先端に流れるまで針を垂直に保持する。染料の漂白を防ぐために、針先を傷つけずに容器をアルミホイルで覆います。
トランスファーピペットまたはマイクロピペッターを使用して、長方形のカバースリップの中央にヘプタン接着剤の小さな滴を置き、蒸発させます。絨毛膜を機械的に除去するために、適切に老化した胚板をハロカーボン油27の薄層で覆い、卵殻を透明にする。プレートをトランス照明で解剖顕微鏡で見て胚段階を確認し、卵割段階の胚を選択します。
細かいピンセットを使用して、背側付属器をつかんで所望の段階の胚を拾い上げ、両面テープで覆われた準備されたスライドガラスに移す。胚をテープの上に置き、油の移動を最小限に抑えます。胚を直接突くことなくピンセットの先端の側面でなでることによって、テープの表面を横切って静かに転がします。
絨毛膜がテープに付着して亀裂が入るまで胚を転がし続けます。絨毛膜が割れたら、胚を転がして、テープに貼り付けられたままの絨毛膜から分離します。胚をテープよりも接着性の低い絨毛膜の上にロールバックします。
胚をピンセットで優しくこすり、ピンセットに付着させて転写します。次に、胚をカバースリップに移し、接着剤に接触させて胚を所定の位置に保持し、ピンセットから分離する。カバースリップ上の胚の向きを調整します。
胚の入ったカバースリップを乾燥室に入れ、密封することにより、胚を5〜12分間乾燥させる。カバースリップをチャンバーから取り出し、ハロカーボンオイル700を一滴入れ、さらなる乾燥を防ぐために胚を覆う。解剖範囲でそれらを調べ、胚が適切に乾燥されていればマイクロインジェクションに進みます。
4X対物レンズを光路に配置し、顕微鏡のフォーカスノブを使用して、胚を焦点を合わせます。ステージコントロールを使用して、胚を水平方向に視野の中心に移動します。胚を視野の端に保ち、針を下げる準備をするためにパンを離します。
同じ焦点面にとどまり、針先を下げ、胚と一緒に視野に見えるようにします。注射液の一部をハロカーボンオイル700に分配して、針が機能していることを確認してください。成功すると、針先の近くの油に溶液の泡が現れます。
ステージコントロールを使用して、先端が胚を優しく穿刺してその中に入るまで、胚を針先に向かって動かします。同時に、一過性の透明な斑点が針先の部位に現れ、胚への溶液移入が成功したことを示すまで、注射溶液の流れを開始する。スライドホルダーを使用して、共焦点顕微鏡のカバースリップを固定します。
カバースリップは壊れやすいので注意してください。共焦点顕微鏡の落射蛍光機能を使用して胚を40倍の対物レンズで検査し、進行する前に胚中の蛍光4が見えることを確認します。ライブ イメージングでは、同期段階で、画像サイズを 512 x 512 ピクセル、行平均を 3、フレーム レートを 0.1 フレーム/秒に設定します。
BODIPY 493 503色素を注入した後、針先が挿入された部位に局在し、次いで注射部位に隣接して拡散した。24分後、色素は胚の中点を越えて拡散した。オルガネラの運動性を、BODIPY 493 503およびLysoTracker Redで胚に注入することによってモニターした。
粒子像速度測定解析により、胚内容物が胚の中央領域に収束し、細胞質が胚の内部に流れ込んでいることが明らかになった。ER-Tracker Greenを使用したERのラベリングは、核エンベロープの鮮明な分解能を提供し、主要な細胞周期段階の視覚化を可能にします。胚を胚盤皮段階でMitoView 633で注射し、4時間後に画像化した。
画像は、生殖帯伸長中の胚の神経外胚葉系細胞を示す。細胞化胚にBODIPY 493 503とSiRチューブリンの混合物を注入し、これは脂肪滴が微小管に沿って双方向に移動することを示している。液体を注入できるように、胚を部分的に乾燥させなければならない。
乾燥が少なすぎると、注入時に胚が漏れ、乾燥が多すぎると胚が死滅します。動く細胞小器官のビデオは、多様な画像解析技術によって特徴付けることができる。粒子追跡は個々の細胞小器官の挙動を明らかにし、粒子イメージング速度測定はバルクフローを明らかにする。
