초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 대규모 운동을 겪습니다. 우리의 프로토콜은 세포 배양을 위해 개발 된 형광 염료를 사용하여이 움직임을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 형광 단백질에 비해, 상업적으로 이용가능한 형광 프로브는 더 밝고 스펙트럼의 더 넓은 범위에 걸쳐 있다.
그들은 멀티플렉스 공동 표지를 허용하고 모든 유전 적 배경에서 사용할 수 있습니다. 배아를 건조시키는 데 얼마나 오래 걸리는지 알기 위해서는 연습과 시행 착오가 필요하므로 주사 중에 파열되거나 말라서 발달을 멈 춥니 다. 시작하려면 바늘 풀러의 모세관 홀더에 모세관을 놓고 날개 너트를 사용하여 고정하여 주사 바늘 준비를 시작하십시오.
모세관의 중심을 발열체와 맞춥니다. 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러에서 적절한 설정을 선택하십시오. 해부 현미경을 사용하여 품질 관리 테스트를 수행하십시오.
바늘을 공중에 매달린 바늘 끝으로 퍼티에 수평으로 누르십시오. 바늘을 뚜껑으로 덮고 사용할 때까지 보관하십시오. 마이크로 피펫에 부착 된 바늘 로딩 팁을 사용하여 기포를 포획하지 않고 주사 용액 한 마이크로 리터를 팁에 그립니다.
장갑을 사용하여 바늘을 한 손으로 잡고 팁이 멀어지도록 잡고 로딩 팁을 삽입하십시오. 바늘 팁 근처에 액체를 분배하고 피펫을 제거한 다음 액체가 팁으로 흐를 때까지 바늘을 수직으로 잡으십시오. 염료의 표백을 방지하기 위해 바늘 끝을 손상시키지 않고 알루미늄 호일로 용기를 덮으십시오.
전사 피펫 또는 마이크로 피펫터를 사용하여 직사각형 커버 슬립의 중앙에 작은 헵탄 접착제 방울을 놓고 증발시킵니다. 쵸리온을 기계적으로 제거하기 위해, 적절하게 숙성된 배아 플레이트를 할로카본 오일 27의 얇은 층으로 덮어 달걀 껍질을 투명하게 돌립니다. 트랜스 조명으로 해부 현미경으로 플레이트를보고 배아 단계를 확인하고 절단 단계에서 배아를 선택하십시오.
미세한 핀셋을 사용하여 등쪽 부속기를 움켜 잡고 양면 테이프로 덮인 준비된 유리 슬라이드로 옮겨 원하는 단계의 배아를 집어 들으십시오. 배아를 테이프에 올려 놓고 기름의 전달을 최소화하십시오. 배아를 테이프 표면을 가로 질러 부드럽게 굴려 핀셋 끝의 측면을 직접 찌르지 않고 밀어 넣으십시오.
chorion이 테이프에 달라 붙고 균열이 생길 때까지 배아를 계속 굴립니다. chorion 균열 후에, 테이프에 붙어있는 chorion에서 그것을 분리하기 위하여 배아를 계속 구르십시오. 배아를 테이프보다 접착력이 떨어지는 chorion에 다시 굴립니다.
전달을 위해 핀셋에 부착 될 때까지 핀셋으로 배아를 부드럽게 문지릅니다. 그런 다음 배아를 덮개 슬립으로 옮기고 접착제와 접촉시켜 배아를 제자리에 고정시키고 핀셋에서 분리하십시오. 커버 슬립에서 배아의 방향을 조정하십시오.
배아와 함께 커버 슬립을 건조 챔버에 넣고 밀봉하여 배아를 다섯 ~ 12 분 동안 건조하게하십시오. 챔버로부터 커버 슬립을 떼어내고, 할로카본 오일(700)을 한 방울 떨어뜨리고, 배아를 덮어 더 이상의 건조를 방지한다. 해부 범위에서 검사하고 배아가 제대로 건조되면 미세 주사를 진행하십시오.
4X 목표를 광 경로에 놓고 현미경의 초점 노브를 사용하여 배아를 초점으로 조정하십시오. 스테이지 컨트롤을 사용하여 배아를 시야의 중앙으로 수평으로 이동합니다. 배아를 시야의 가장자리에 두고 바늘을 낮추기 위해 멀리 치우십시오.
동일한 초점 평면을 유지하면서 바늘 끝을 낮추고 배아와 함께 시야에서 볼 수 있도록하십시오. 주사액 중 일부를 할로카본 오일(700)에 분배하여 바늘이 작동하는지 확인하십시오. 성공하면 바늘 끝 근처의 오일에 용액 거품이 나타납니다.
스테이지 컨트롤을 사용하여 팁이 배아에 부드럽게 구멍을 뚫고 들어갈 때까지 배아를 바늘 끝쪽으로 움직입니다. 동시에, 바늘 끝의 부위에 일시적인 명확한 반점이 나타날 때까지 주사 용액의 흐름을 시작하여 배아로의 성공적인 용액 전달을 나타냅니다. 슬라이드 홀더를 사용하여 공초점 현미경에 커버 슬립을 고정하십시오.
커버 슬립이 깨지기 쉽기 때문에 주의하십시오. 40X 목적으로 공초점 현미경 상의 후피형광 기능을 사용하여 배아를 검사하고 진행하기 전에 배아의 플루오로 4가 보이는지 확인하십시오. 라이브 이미징의 경우 동기화 단계에서 이미지 크기를 512x512픽셀, 라인 평균을 3개, 프레임 속도를 초당 0.1프레임으로 설정합니다.
BODIPY 493 503 염료를 주입한 후, 바늘 팁이 삽입된 부위에 국소화한 다음, 주사 부위에 인접하여 확산시켰다. 24 분 후, 염료는 배아의 중간 지점을 지나서 확산되었습니다. 배아에 BODIPY 493 503 및 LysoTracker Red를 주입하여 소기관 운동성을 모니터링하였다.
입자 이미지 velocimetry 분석은 배아 내용이 배아의 중앙 영역에 수렴되어 세포질이 배아의 내부로 유입되는 것으로 나타났습니다. ER-Tracker Green을 사용하는 ER의 라벨링은 핵 외피의 생생한 해상도를 제공하여 주요 세포 주기 단계를 시각화할 수 있습니다. 배아를 배반배엽 단계에서 MitoView 633으로 주사하고 4시간 후에 영상화하였다.
이미지는 배아 밴드 확장에서 배아의 신경 외배엽 세포를 보여줍니다. 세포화 배아에 BODIPY 493 503 및 SiR Tubulin의 혼합물이 주입되었는데, 이는 지질 방울이 미세소관을 따라 양방향으로 이동한다는 것을 보여준다. 배아는 액체가 주입 될 수 있도록 부분적으로 건조되어야합니다.
너무 적은 건조는 주입 할 때 배아가 누출되도록하고, 너무 많은 건조는 배아를 죽일 것입니다. 움직이는 소기관의 비디오는 다양한 이미지 분석 기술을 통해 특성화 될 수 있습니다. 입자 추적은 개별 소기관의 행동을 드러내고, 입자 이미징 속도는 벌크 흐름을 나타냅니다.
