Zelluläre Mikrotubuli-Arrays enthalten Subpopulationen von Mikrotubuli mit unterschiedlichen dynamischen Eigenschaften, wie sie für die Funktion erforderlich sind. Dieses Protokoll befasst sich damit, wie die kollektive Aktivität von Regulatoren proximale Mikrotubuli-Subpopulationen mit unterschiedlichen Eigenschaften verleiht. Dieser Bottom-up-Restitutionsassay ermöglicht es uns, gleichzeitig die Organisation und Dynamik proximaler Mikrotubulipopulationen wie einzelne Mikrotubuli und Bündel zu visualisieren und die Mechanismen zu entschlüsseln, die ihrer Selbstorganisation zugrunde liegen.
Die Mehrkomponenten-Rekonstitution erfordert die Optimierung experimenteller Parameter wie pH-Wert, Ionenstärke und Proteinkonzentration, während die Aktivität jedes einzelnen erhalten bleibt. Die systematische Analyse einzelner Komponenten vor Multi-Protein-Assays ist äußerst hilfreich. Zu Beginn pipettieren Sie eine Mischung aus 4,5 Mikrolitern BRB ADDTT in einem Mikroliter Mikrotubuli-Lösung auf einen Objektträger.
Mit einem 18 x 18 Millimeter großen Deckglas abdecken und die Kanten entweder mit klarem Nagellack oder VALAP-Dichtungsmittel versiegeln. Positionieren Sie das TIRF-Objektiv unter dem Deckglas. Visualisieren Sie die neu polymerisierten Mikrotubuli bei einer Wellenlänge, die für das fluoreszierend markierte Tubulin in der hellen Mischung geeignet ist, um zu bestimmen, welche Verdünnung von Mikrotubuli in den bevorstehenden Experimenten verwendet werden soll.
Bestimmen Sie die Laserintensität für das Experiment empirisch so, dass alle fluoreszierenden Proteine beleuchtet werden, aber im Laufe des Experiments keiner signifikanten Photobleiche unterzogen werden. Stellen Sie die Temperatur des Mikroskops auf 28 Grad Celsius ein, um dynamische Mikrotubuli anzuzeigen. Verwenden Sie Linsenpapier, um ein 100-faches Objektiv mit 70% Ethanol zu reinigen.
Verwenden Sie die beste Kombination aus Filterwürfeln und Emissionsfiltern, abhängig von den abzubildenden Leuchtstoffkanälen. Richten Sie die Bildgebungssequenz ein. Für ein Experiment mit 647 Nanometer-Fluorophor-markierten biotinylierten Mikrotubuli, 560-Nanometer-Fluorophor-markierten nicht-biotinylierten Mikrotubuli in löslichem Tubulin und GFP-markiertem Protein von Interesse, stellen Sie die 488 Nanometer-, 560 Nanometer- und 647 Nanometer-Kanäle alle 10 Sekunden für 20 Minuten ab.
Um ein Referenzbild von Bündeln vor der Zugabe von löslichem Tubulin und Mikrotubuli-assoziiertem Protein aufzunehmen, richten Sie eine Sequenz mit je einem Bild in 560-Nanometer- und 647-Nanometer-Wellenlängenkanälen ein. Überprüfen Sie die Position des Laserstrahls an der Decke über dem Mikroskop und nehmen Sie Änderungen am Strahl mithilfe der Software vor. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahler ausgerichtet ist.
Geben Sie vor der Bildgebung einen Tropfen Mikroskop-Tauchöl in das Objektiv. Bereiten Sie die lösliche Tubulinmischung vor, während Sie sie auf Eis halten, und schleudern Sie die Mischung ab. Um Mikrotubuli über Biotin-NeutrAvidin-Biotin-Bindung zu immobilisieren, fließen Sie zuerst in etwa 7,5 Mikroliter NeutrAvidin-Lösung, bis die Kammer gefüllt ist, und inkubieren Sie fünf Minuten lang.
Mit 10 Mikrolitern MB kalt waschen. Gießen Sie 7,5 Mikroliter des blockierenden Proteins KC ein und inkubieren Sie für zwei Minuten. Mit 10 Mikrolitern MB warm waschen, um die Kammer für die Einführung von Mikrotubuli vorzubereiten.
Verdünnen Sie den Bestand an biotinylierten Mikrotubuli in BRB ADDTT und fügen Sie einen Mikroliter dieser Verdünnung zu neun Mikrolitern MB warm hinzu. Gießen Sie die Mischung in die Kammer und inkubieren Sie sie für 10 Minuten. Nicht immobilisierte Mikrotubuli mit 10 Mikrolitern MB warm wegwaschen.
Gießen Sie 7,5 Mikroliter warmes KC in die Kammer und inkubieren Sie für zwei Minuten. Während der Inkubation stellen Sie eine zwei-nanomolare Lösung des Vernetzungs- oder Proteins PRC1 in KC vor und schleudern die Lösung aus. Gießen Sie 10 Mikroliter dieser Lösung in die Bildgebungskammer und inkubieren Sie fünf Minuten lang.
Um Bündel herzustellen, lassen Sie 10 Mikroliter nicht biotinylierte Mikrotubuli in die Kammer und inkubieren Sie sie für 10 Minuten. Waschen Sie die Kammer zweimal mit 10 Mikrolitern MB warm. Bereiten Sie während der 10-minütigen Inkubationszeit 10 Mikroliter Assay-Mischung mit interessanten Proteinen, löslichem Tubulin, Nukleotiden, Sauerstofffängern und Antioxidantien vor und schleudern Sie sie aus.
Halten Sie die Mischung auf Eis. Laden Sie die vorbereitete Bildgebungskammer, die auf den Objektträgerhalter geklebt ist, auf das 100X TIRF-Objektiv. Verwenden Sie die Kanäle 560 Nanometer und 647 Nanometer, um ein Sichtfeld zu finden, das eine optimale Anzahl und Dichte einzelner Mikrotubuli und Bündel enthält.
Sobald ein Sichtfeld identifiziert ist, nehmen Sie ein Referenzbild auf. Lassen Sie die Assay-Mischung vorsichtig einfließen, ohne die Bildgebungskammer zu stören. Versiegeln Sie die offenen Enden der Kammer mit VALAP-Dichtstoff.
Beobachten Sie die Mikrotubuli und starten Sie die Bildgebungssequenz. Nach der Immobilisierung von Mikrotubulisamen und der Erzeugung von Bündeln wurden Fluoreszenzbilder erhalten. Einzelne Mikrotubuli wurden durch Fluoreszenzsignal im 647-Nanometer-Kanal identifiziert, während Mikrotubuli als vorgeformte Bündel identifiziert wurden, wenn sie Fluoreszenzsignale in beiden Kanälen zeigten.
Die Dynamik einzelner Mikrotubuli und PRC1-vernetzter Bündel wurde in Gegenwart der Proteine KIF4A und CLASP1 untersucht, was zeigte, dass sich die einzelnen Mikrotubuli im Verlauf des Assays verlängern, während das Wachstum von vernetzten Mikrotubuli zum Stillstand kommt. Achten Sie darauf, polymerisierte Mikrotubuli bei oder über Raumtemperatur zu halten. Halten Sie lösliches Tubulin auf Eis und schützen Sie die Bildgebungskammer und fluoreszierend markierte Mikrotubuli und Proteine vor Licht.
Diese Assays lieferten mechanistische Einblicke in die Art und Weise, wie ein Proteinmodul an der mitotischen Spindel die Dynamik von zwei verschiedenen Mikrotubulipopulationen, die in der Spindel koexistieren, unterschiedlich regulieren könnte.
