Gli array di microtubuli cellulari contengono sottopopolazioni di microtubuli con proprietà dinamiche distinte come richiesto per la funzione. Questo protocollo affronta il modo in cui l'attività collettiva dei regolatori conferisce sottopopolazioni di microtubuli prossimali con proprietà distinte. Questo test di restituzione bottom-up ci consente di visualizzare simultaneamente l'organizzazione e le dinamiche delle popolazioni di microtubuli prossimali come singoli microtubuli e fasci e di decifrare i meccanismi alla base della loro auto-organizzazione.
La ricostituzione multicomponente richiede l'ottimizzazione dei parametri sperimentali come pH, forza ionica e concentrazione proteica preservando l'attività di ciascuno. L'analisi sistematica dei singoli componenti prima dei saggi multiproteici è estremamente utile. Per iniziare, pipettare una miscela di 4,5 microlitri di BRB ADDTT in un microlitro di soluzione di microtubuli su un vetrino per microscopio.
Coprire con un coperchio di 18 x 18 millimetri e sigillare i bordi con smalto trasparente o sigillante VALAP. Posizionare l'obiettivo TIRF sotto il coperchio. Visualizza i microtubuli appena polimerizzati a una lunghezza d'onda appropriata per la tubulina marcata fluorescentemente nella miscela luminosa per determinare quale diluizione di microtubuli utilizzare nei prossimi esperimenti.
Determinare empiricamente l'intensità del laser per l'esperimento in modo tale che tutte le proteine fluorescenti siano illuminate, ma non subiscano un significativo fotosbiancamento nel corso dell'esperimento. Impostare la temperatura del microscopio a 28 gradi Celsius per visualizzare i microtubuli dinamici. Usa la carta per lenti per pulire un obiettivo 100X con il 70% di etanolo.
Utilizzare la migliore combinazione di cubi filtranti e filtri di emissione a seconda dei canali fluorescenti da visualizzare. Impostare la sequenza di imaging. Per un esperimento con microtubuli biotinilati marcati con fluoroforo a 647 nanometri, microtubuli non biotinilati marcati con fluoroforo a 560 nanometri in tubulina solubile e proteina di interesse marcata GFP, immagine dei canali a 488 nanometri, 560 nanometri e 647 nanometri ogni 10 secondi per 20 minuti qualsiasi.
Per acquisire un'immagine di riferimento dei fasci prima dell'aggiunta di tubulina solubile e proteina associata ai microtubuli, impostare una sequenza con un'immagine ciascuna in canali di lunghezza d'onda di 560 nanometri e 647 nanometri. Controllare la posizione del raggio laser sul soffitto sopra il microscopio e apportare modifiche al raggio utilizzando il software. Assicurarsi che l'illuminatore laser sia allineato.
Prima dell'imaging, aggiungere una goccia di olio per immersione al microscopio all'obiettivo. Preparare la miscela solubile di tubulina mantenendola sul ghiaccio e far girare la miscela. Per immobilizzare i microtubuli tramite il legame biotina-NeutrAvidina-biotina, prima fluire in circa 7,5 microlitri di soluzione di NeutrAvidin fino a quando la camera non viene riempita e incubare per cinque minuti.
Lavare con 10 microlitri di MB a freddo. Fluire in 7,5 microlitri della proteina bloccante KC e incubare per due minuti. Lavare con 10 microlitri di MB caldo per preparare la camera per l'introduzione di microtubuli.
Diluire lo stock di microtubuli biotinilati in BRB ADDTT e aggiungere un microlitro di questa diluizione a nove microlitri di MB caldo. Far scorrere la miscela nella camera e incubare per 10 minuti. Lavare via i microtubuli non immobilizzati con 10 microlitri di MB caldi.
Flusso di 7,5 microlitri di KC caldo nella camera e incubazione per due minuti. Durante l'incubazione, preparare una soluzione a due nanomolari del reticolo o della proteina PRC1 in KC e far girare la soluzione. Flusso di 10 microlitri di questa soluzione nella camera di imaging e incubare per cinque minuti.
Per fare fasci, far fluire 10 microlitri di microtubuli non biotinilati nella camera e incubare per 10 minuti. Lavare la camera due volte con 10 microlitri di MB a caldo. Durante il tempo di incubazione di 10 minuti, preparare 10 microlitri di miscela di saggi contenenti proteine di interesse, tubulina solubile, nucleotidi, spazzini di ossigeno e antiossidanti e spin-down.
Mantenere il composto sul ghiaccio. Caricare la camera di imaging preparata nastrata sul supporto del vetrino sull'obiettivo 100X TIRF. Usa i canali a 560 nanometri e 647 nanometri per trovare un campo visivo che contenga un numero e una densità ottimali di singoli microtubuli e fasci.
Una volta identificato un campo visivo, scatta un'immagine di riferimento. Fluire con attenzione nella miscela di analisi senza disturbare la camera di imaging. Sigillare le estremità aperte della camera con il sigillante VALAP.
Osservare i microtubuli e avviare la sequenza di imaging. Dopo aver immobilizzato i semi di microtubuli e generato fasci, sono state ottenute immagini di fluorescenza. I singoli microtubuli sono stati identificati dal segnale fluorescente nel canale a 647 nanometri, mentre i microtubuli sono stati identificati come fasci preformati quando hanno visualizzato segnali fluorescenti in entrambi i canali.
La dinamica dei singoli microtubuli e dei fasci reticolati PRC1 è stata studiata in presenza delle proteine KIF4A e CLASP1, che hanno rivelato che i singoli microtubuli si allungano nel corso del test, mentre la crescita dei microtubuli reticolati è in stallo. Fare attenzione a mantenere i microtubuli polimerizzati a temperatura ambiente o al di sopra di essa. Mantenere la tubulina solubile sul ghiaccio e proteggere la camera di imaging e i microtubuli e le proteine marcati fluorescenti dalla luce.
Questi saggi hanno fornito informazioni meccanicistiche su come un modulo proteico trovato nel fuso mitotico potrebbe regolare in modo differenziale la dinamica di due diverse popolazioni di microtubuli che coesistono nel fuso.
