מערכי מיקרוטובולים תאיים מכילים תת-אוכלוסיות של מיקרוטובולות בעלות תכונות דינמיות ייחודיות כנדרש לתפקוד. פרוטוקול זה מתייחס לאופן שבו הפעילות הקולקטיבית של הרגולטורים מעניקה תת-אוכלוסיות מיקרו-רובוטיות פרוקסימליות עם תכונות שונות. בדיקת השבתה מלמטה למעלה זו מאפשרת לנו לדמיין בו זמנית את הארגון והדינמיקה של אוכלוסיות מיקרוטובולות פרוקסימליות כגון מיקרוטובולות וחבילות בודדות, ולפענח את המנגנונים העומדים בבסיס הארגון העצמי שלהם.
שחזור רב-רכיבים דורש אופטימיזציה של פרמטרים ניסיוניים כמו pH, חוזק יוני וריכוז חלבונים תוך שמירה על הפעילות של כל אחד מהם. ניתוח שיטתי של רכיבים בודדים לפני בדיקות מרובות חלבונים הוא מאוד מועיל. כדי להתחיל, פיפטה תערובת של 4.5 מיקרוליטרים של BRB ADDTT במיקרוליטר אחד של פתרון microtubule על שקופית מיקרוסקופ.
לכסות עם כיסוי 18 על 18 מ"מ ולאטום את הקצוות עם לק ברור או איטום VALAP. מקם את מטרת TIRF מתחת לכיסוי. דמיינו את המיקרוטובולות שעברו פולימר חדשים באורך גל המתאימים לטבולין המסומן בפלואורסצנטיות בתמהיל הבהיר כדי לקבוע באיזה דילול של מיקרוטובולות להשתמש בניסויים הקרובים.
קבעו את עוצמת הלייזר לניסוי בצורה אמפירית כך שכל החלבונים הפלואורסצנטיים מוארים, אך אינם עוברים צילום משמעותי במהלך הניסוי. הגדר את טמפרטורת המיקרוסקופ ל 28 מעלות צלזיוס כדי להציג מיקרוטובולות דינמיות. השתמש בנייר עדשה כדי לנקות מטרה 100X עם 70% אתנול.
השתמש בשילוב הטוב ביותר של קוביות מסנן ומסנני פליטה בהתאם לערוצי הפלואורסצנט שיש לדמות. הגדר את רצף ההדמיה. לניסוי עם 647 ננומטר פלואורופור שכותרתו biotinylated microtubules, 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו מיקרוטובולות לא ביו-ביוטינילט בצינורולין מסיס, וחלבון GFP שכותרתו של עניין, תמונה 488 ננומטר, 560 ננומטר, ו 647 ננומטר ערוצים כל 10 שניות במשך 20 כל דקות.
כדי ללכוד תמונת ייחוס של חבילות לפני התוספת של טובולין מסיס וחלבון הקשור למיקרוטובולה, הגדר רצף עם תמונה אחת כל אחד בתעלות 560 ננומטר ו 647 ננומטר אורך גל. בדוק את המיקום של קרן לייזר על התקרה מעל מיקרוסקופ ולבצע שינויים כדי לקרן באמצעות תוכנה. ודא כי מאיר הלייזר מיושר.
לפני ההדמיה, להוסיף טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ למטרה. מכינים את תערובת טובולין מסיס תוך שמירה על קרח ומסובבים את התערובת. כדי לשתק microtubules באמצעות ביוטין-NeutrAvidin-ביוטין הצמדה, זרימה ראשונה בכ 7.5 מיקרוליטרים של פתרון NeutrAvidin עד שהתא מתמלא ודגר במשך חמש דקות.
יש לשטוף עם 10 מיקרוליטרים של קור MB. זרימה ב-7.5 מיקרוליטרים של החלבון החוסם KC ודגרה לשתי דקות. לשטוף עם 10 microliters של MB חם כדי להכין את החדר להקדמה של microtubules.
לדלל את המלאי של microtubules biotinylated ב- BRB ADDTT ולהוסיף מיקרוליטר אחד של דילול זה לתשעה מיקרוליטרים של MB חם. מזרימים את התערובת לתוך התא ודגורים במשך 10 דקות. יש לשטוף מיקרוטובולים שאינם משותקים עם 10 מיקרוליטרים של MB חם.
יש להזרים 7.5 מיקרוליטרים של KC חם לתוך התא ולדגור במשך שתי דקות. במהלך הדגירה, להכין פתרון שני nanomolar של crosslink או חלבון PRC1 ב KC ולסובב את הפתרון. זרימה 10 מיקרוליטרים של פתרון זה לתוך תא ההדמיה ודגר במשך חמש דקות.
כדי ליצור חבילות, זרימה 10 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים שאינם ביו-ביוטינילים לתוך התא ודגרה במשך 10 דקות. לשטוף את התא פעמיים עם 10 מיקרוליטרים של MB חם. במהלך זמן הדגירה של 10 דקות, הכינו 10 מיקרוליטרים של תערובת בדיקה המכילה חלבונים מעניינים, טובולין מסיס, נוקלאוטידים, אוכלי נבלות חמצן ונוגדי חמצון וסובבו אותה.
שמור את התערובת על קרח. טען את תא ההדמיה המוכן המודבק למחזיק השקופית במטרה 100X TIRF. השתמש בתעלות 560 ננומטר ו-647 ננומטר כדי למצוא שדה ראייה המכיל מספר וצפיפות אופטימליים של מיקרוטובולות וחבילות בודדות.
לאחר זיהוי שדה תצוגה, צולם תמונת הפניה. בזהירות לזרום בתערובת הבדיקה מבלי להפריע לתא ההדמיה. לאטום את הקצוות הפתוחים של התא עם איטום VALAP.
שים לב למיקרוטובולות ולהתחיל את רצף ההדמיה. לאחר השתקת זרעי microtubule ויצירת חבילות, תמונות פלואורסצנטיות התקבלו. מיקרוטובולות בודדות זוהו על ידי אות פלואורסצנטי בערוץ 647 ננומטר, ואילו מיקרוטובולות זוהו כחבילות מעוצבות מראש כאשר הם הציגו אותות פלואורסצנטיים בשני הערוצים.
הדינמיקה של מיקרוטובולים בודדים וחבילות מוצלבות של PRC1 נחקרה בנוכחות החלבונים KIF4A ו- CLASP1, אשר גילו כי microtubules יחיד להאריך במהלך הבדיקה, בעוד הצמיחה של microtubules מקושר תקוע. יש להקפיד לשמור על מיקרוטובולות פולימריות בטמפרטורת החדר או מעליה. שמור טובולין מסיס על קרח והגן על תא ההדמיה ועל מיקרוטובולות וחלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית מפני אור.
בדיקות אלה סיפקו תובנה מכאניסטית על האופן שבו מודול חלבון שנמצא בציר המיטוטי יכול לווסת באופן דיפרנציאלי את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות מיקרוטובולות שונות שחיות יחד בציר.
