Hücresel mikrotübül dizileri, fonksiyon için gerekli olduğu gibi farklı dinamik özelliklere sahip mikrotübüllerin alt popülasyonlarını içerir. Bu protokol, düzenleyicilerin kolektif aktivitesinin, farklı özelliklere sahip proksimal mikrotübül alt popülasyonlarını nasıl verdiğini ele almaktadır. Bu aşağıdan yukarıya tazminat testi, tek mikrotübüller ve demetler gibi proksimal mikrotübül popülasyonlarının organizasyonunu ve dinamiklerini eşzamanlı olarak görselleştirmemizi ve öz-organizasyonlarının altında yatan mekanizmaları deşifre etmemizi sağlar.
Çok bileşenli sulandırma, her birinin aktivitesini korurken pH, iyonik mukavemet ve protein konsantrasyonu gibi deneysel parametrelerin optimize edilmesini gerektirir. Çok proteinli tahlillerden önce bireysel bileşenlerin sistematik analizi son derece yararlıdır. Başlamak için, bir mikrolitre mikrotübül çözeltisi içinde 4.5 mikrolitre BRB ADDTT karışımını bir mikroskop slaytına pipetleyin.
18 x 18 milimetrelik bir kapak kayışı ile örtün ve kenarları şeffaf oje veya VALAP sızdırmazlık maddesi ile kapatın. TIRF hedefini kapak fişinin altına yerleştirin. Yaklaşan deneylerde mikrotübüllerin hangi seyreltilmesinin kullanılacağını belirlemek için yeni polimerize edilmiş mikrotübülleri parlak karışımdaki floresan etiketli tübülin için uygun bir dalga boyunda görselleştirin.
Deney için lazer yoğunluğunu ampirik olarak belirleyin, böylece tüm floresan proteinleri aydınlatılır, ancak deneyin zaman içinde önemli bir fotobeyazlatmaya maruz kalmazlar. Dinamik mikrotübülleri görüntülemek için mikroskop sıcaklığını 28 santigrat dereceye ayarlayın. 100X'lik bir hedefi %70 etanol ile temizlemek için lens kağıdı kullanın.
Görüntülenecek floresan kanallara bağlı olarak filtre küpleri ve emisyon filtrelerinin en iyi kombinasyonunu kullanın. Görüntüleme sırasını ayarlayın. 647 nanometre florofor etiketli biyotinillenmiş mikrotübül, çözünür tübülin içinde 560 nanometre florofor etiketli biyotinillenmemiş mikrotübüller ve GFP etiketli protein ile yapılan bir deney için, 488 nanometre, 560 nanometre ve 647 nanometre kanallarını her 10 saniyede bir 20 dakika boyunca görüntüleyin.
Çözünür tübülin ve mikrotübülle ilişkili proteinin eklenmesinden önce demetlerin referans görüntüsünü yakalamak için, her biri 560 nanometre ve 647 nanometre dalga boyu kanallarında bir görüntü içeren bir dizi oluşturun. Lazer ışınının mikroskop üzerindeki tavandaki konumunu kontrol edin ve yazılımı kullanarak ışında değişiklikler yapın. Lazer aydınlatıcının hizalandığından emin olun.
Görüntülemeden önce, hedefe bir damla mikroskop daldırma yağı ekleyin. Çözünür tübülin karışımını buz üzerinde tutarken hazırlayın ve karışımı aşağı doğru döndürün. Mikrotübülleri biyotin-NeutrAvidin-biotin bağlantısı yoluyla hareketsiz hale getirmek için, önce oda dolana kadar yaklaşık 7.5 mikrolitre NeutrAvidin çözeltisi içinde akıtın ve beş dakika boyunca inkübe edin.
10 mikrolitre MB soğuk ile yıkayın. Bloke edici protein KC'nin 7.5 mikrolitresinde akın ve iki dakika boyunca inkübe edin. Odayı mikrotübüllerin sokulmasına hazırlamak için 10 mikrolitre MB ılık ile yıkayın.
BRB ADDTT'deki biyotinile mikrotübüllerin stokunu seyreltin ve bu seyreltmenin bir mikrolitresini dokuz mikrolitre MB sıcaklığa ekleyin. Karışımı odaya akıtın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Hareketsiz mikrotübülleri 10 mikrolitre MB ılık ile yıkayın.
Odaya 7.5 mikrolitre ılık KC akışı yapın ve iki dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, KC'de çapraz bağ veya protein PRC1'in iki nanomolar çözeltisini hazırlayın ve çözeltiyi aşağı doğru döndürün. Bu çözeltinin 10 mikrolitresini görüntüleme odasına akıtın ve beş dakika boyunca inkübe edin.
Demetler yapmak için, odaya 10 mikrolitre biyotinillenmemiş mikrotübül akıtın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Odayı 10 mikrolitre MB ılık ile iki kez yıkayın. 10 dakikalık inkübasyon süresi boyunca, ilgilenilen proteinleri, çözünür tübülini, nükleotitleri, oksijen temizleyicilerini ve antioksidanları içeren 10 mikrolitre tahlil karışımı hazırlayın ve aşağı doğru çevirin.
Karışımı buz üzerinde tutun. Slayt tutucuya bantlanmış hazırlanmış görüntüleme odasını 100X TIRF hedefine yükleyin. Tek mikrotübüllerin ve demetlerin optimum sayısını ve yoğunluğunu içeren bir görüş alanı bulmak için 560 nanometre ve 647 nanometre kanallarını kullanın.
Bir görüş alanı tanımlandıktan sonra, bir referans görüntüsü alın. Görüntüleme odasını rahatsız etmeden tahlil karışımında dikkatlice akıtın. Odanın açık uçlarını VALAP sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
Mikrotübülleri gözlemleyin ve görüntüleme dizisini başlatın. Mikrotübül tohumları hareketsiz hale getirildikten ve demetler oluşturulduktan sonra floresan görüntüler elde edildi. Tek mikrotübüller, 647 nanometre kanalındaki floresan sinyalle tanımlanırken, mikrotübüller her iki kanalda da floresan sinyalleri gösterdiğinde önceden oluşturulmuş demetler olarak tanımlandı.
Tek mikrotübüllerin ve PRC1 çapraz bağlı demetlerin dinamikleri, KIF4A ve CLASP1 proteinlerinin varlığında incelenmiştir, bu da tek mikrotübüllerin tahlil boyunca uzadığını, çapraz bağlı mikrotübüllerin büyümesinin ise durduğunu ortaya koymuştur. Polimerize mikrotübülleri oda sıcaklığında veya üzerinde tutmaya dikkat edin. Çözünür tübülini buz üzerinde tutun ve görüntüleme odasını ve floresan etiketli mikrotübülleri ve proteinleri ışıktan koruyun.
Bu analizler, mitotik iğde bulunan bir protein modülünün iş milinde bir arada bulunan iki farklı mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini farklı şekilde nasıl düzenleyebileceğine dair mekanik bir bakış açısı sağlamıştır.
