يسمح هذا البروتوكول باكتشاف مبيدات نيماتيسيد جديدة لمكافحة Ditylenchus dipsaci عن طريق تقنية الزراعة والشاشات الكيميائية متوسطة الإنتاجية. تسمح بساطة هذه التقنية بفحص آلاف المركبات أسبوعيا لتحديد المركبات ذات القدرة على النيماتيكات. يمكن لهذه التقنية تحديد مركبات جديدة لقتل الديدان الخيطية الطفيلية النباتية للمحاصيل ، وبالتالي زيادة الإمدادات الغذائية العالمية.
للبدء ، قم بإعداد 500 ملليلتر من أجار المغذيات ، أو وسائط NA ، مع 23 جراما لكل لتر من NA والماء النقي للغاية. باستخدام تقنية معقمة ، صب 25 ملليلتر من وسائط NA المعقمة في 20 طبقا بتري قطره 100 ملم يمكن التخلص منه ، وعمقه 15 ملم. تحضير 500 ملليلتر من وسائط Gamborg B5 ، أو GA ، التي تحتوي على 3.2 جرام لكل لتر من الوسط القاعدي GA مع الحد الأدنى من المواد العضوية ، و 20 جراما لكل لتر من السكروز ، و 15 جراما لكل لتر من الأجار ، والماء المقطر.
باستخدام تقنية معقمة ، صب 50 ملليلتر من وسائط GA المعقمة في 10 أطباق بتري يمكن التخلص منها. لإجراء تعقيم البذور ، صب 150 بذرة بازلاء في كوب معقم سعة لترين مع شريط تحريك بالقرب من لهب موقد بنسن على مقعد المختبر. أضف 200 ملليلتر من 95٪ من الإيثانول إلى البذور وحرك بقوة على طبق التحريك لمدة خمس دقائق.
ثم ، صب الإيثانول في حاوية نفايات. صب محلول التبييض في الكأس لغمر البذور تماما. يحرك المزيج بقوة على طبق يحرك لمدة 20 دقيقة.
ثم ، صب المبيض في حاوية نفايات. صب الماء المقطر في الكأس لغمر البذور وحرك بقوة على طبق التحريك لمدة 20 دقيقة. بعد غسل الماء النهائي ، صب البذور المعقمة في طبق بتري الزجاجي.
للتحقق من وجود تلوث، انقل ست بذور إلى كل صفيحة NA بطول 10 سنتيمترات في غطاء التدفق الرقائقي باستخدام ملقط معقم. رتب البذور حول محيط اللوحة. لف الألواح بشكل فردي في فيلم تغليف مختبري واحتضنها في الظلام لمدة ثلاثة أيام عند 26 درجة مئوية.
في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بصب بذورتين غير ملوثتين على كل صفيحة GA بملقط معقم. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 إلى 10 أيام للسماح للبذور أن تنبت. تحضير 50 ملليلتر من محلول السكروز 20 غرام لكل لتر.
مرشح تعقيم محلول السكروز ووضعها جانبا. في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بقطع قطعة من الأجار تحتوي على أنسجة الجذر من لوحة ثقافة موجودة. ماصة 500 ميكرولتر من محلول السكروز على لوحة GA جديدة مع شتلات البازلاء ووضع مكعب أجار فوق السكروز.
حافظ على الثقافة في صندوق مبطن بورق الألومنيوم في درجة حرارة الغرفة. للحفاظ على الثقافة ، قم بزراعة الديدان الخيطية على ألواح GA الطازجة كل ثمانية إلى تسعة أسابيع. الديدان الخيطية جاهزة للاستخراج بعد حوالي ثمانية أسابيع.
في غطاء التدفق الرقائقي ، قم بقطع أنسجة الآجار والجذر إلى مكعبات طولها سنتيمتر واحد باستخدام مشرط معقم. انقل مكعبات الأجار إلى القمع المبطن بفلتر القهوة وصب الماء المقطر ببطء على الأجار لترطيب فلتر القهوة. قم بإزالة القمع المبطن بفلتر القهوة من الكأس واملأ الكأس بالماء المقطر حتى يلمس مستوى الماء الجزء السفلي من الفلتر بمجرد استبدال القمع المبطن بفلتر القهوة.
قم بتغطية القمع المبطن بفلتر القهوة والكأس بورق الألمنيوم. لجمع الديدان ، قم بإزالة القمع المبطن بفلتر القهوة واستنشاق أعلى 40 ملليلتر من الماء من كوب التجميع ، دون تعطيل الديدان المستقرة. اجمع السائل المتبقي في أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر باستخدام ماصة مصلية بلاستيكية سعة 10 ملليلتر.
لإعداد ألواح الفحص ، صب الماء المقطر الأوتوكلاف في حوض معقم وقم بتوزيع 40 ميكرولتر من الماء المقطر من الحوض الصغير إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا مسطحة القاع مع ماصة متعددة القنوات. أضف مواد كيميائية من ألواح المخزون الكيميائي المكونة من 96 بئرا إلى ألواح الفحص عن طريق التثبيت ثلاث مرات في اللوحة الكيميائية. ثم ، انقل المسامير 10 مرات إلى لوحة الفحص.
لطخة على الورق أمام محلول التنظيف. لحساب عدد الديدان الخيطية من المجموعة ، أولا ، أعد تعليق المجموعة ثم ماصة خمسة ميكرولترات من المحلول باستخدام نصائح منخفضة الاحتفاظ على شريحة. احسب عدد الديدان الخيطية في خمسة ميكرولترات باستخدام مجهر التشريح.
ثم اضبط التركيز على ديدان لكل ميكرولتر باستخدام ماء مقطر معقم. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من العينة إلى كل بئر من لوحات البئر 96 مع ماصة متعددة القنوات وحوض صغير. لف الأطباق بمنشفة ورقية مبللة وضعها في صندوق.
بعد ذلك ، أضف منشفة ورقية رطبة إضافية لتحقيق الاستقرار وضمان الحد الأدنى من حركة الألواح وتثبيتها على وسادة لاصقة في حاضنة اهتزاز بزاوية 20 درجة مئوية تم ضبطها على 200 دورة في الدقيقة. راقب اللوحات في اليوم الخامس تحت مجهر تشريح. عد عدد D.dipsaci المتنقل والإجمالي في ضوابط المذيبات DMSO والآبار المعالجة بالعقاقير.
إذا كانت الديدان غير متحركة ، أضف ميكرولترين من هيدروكسيد الصوديوم المولي إلى تركيز نهائي قدره 40 ملليمولار إلى البئر لتحفيز الحركة. حساب نسبة الديدان المتنقلة. في شاشات D.dipsaci ، يتم تصنيف الآبار التي أنتجت 0٪ من الديدان المتنقلة بشكل متكرر على أنها ضربات قوية.
تم فحص ثلاث لوحات دوائية مختلفة بتركيز 60 ميكرومولار ، حيث تحتوي كل صفيحة دواء على ثلاثة نسخ بيولوجية. تضمنت جميع اللوحات الثلاث 6٪ من عناصر التحكم في المذيبات DMSO فقط. تفتقر العديد من اللوحات التي تحتوي على أدوية من مكتبة الجزيئات الصغيرة إلى أي جزيء له نشاط حيوي يمكن ملاحظته ضد D.dipsaci.
وكان لبعض الصفائح ضربات قابلة للتكرار بالكامل، في حين أن البعض الآخر يحتوي على مبيدات نيماتيسيد مميزة تختلف في نشاطها. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. هنا ، أظهر fluopyram نشاطا قويا في الفحص.
تسبب Fluopyram في تأثير واضح يعتمد على الجرعة على حركة D.dipsaci باستخدام EC50 من 9.3-micromolar. لم يكن للأوكساميل أي تأثير كبير على التنقل حتى تركيز 120 ميكرومولار. لم يكن للأوكساميل أي تأثير كبير على التنقل حتى تركيز 120 ميكرومولار.
أدت إضافة هيدروكسيد الصوديوم إلى تحسين حساسية الفحص في الكشف عن الديدان غير المتحركة. تم استخدام 40 ملليمولار من هيدروكسيد الصوديوم كنقطة نهاية للفحص لتحفيز الحركة لدى الأفراد القادرين ، وبالتالي التمييز بين الديدان المريحة والديدان المريضة. وقد مكن هذا البروتوكول من تحديد المركبات ذات آليات العمل الجديدة ضد D.dipsaci والأنواع الأخرى.
