ويتم تمويل البحوث في مختبر Kaloshian عن طريق منحة من معهد الولايات المتحدة الوطني للأغذية والزراعة (2007-35607-17765). ويتم تمويل البحوث في مختبر روبرتس من المنح المقدمة من الوكالة الأمريكية للتنمية الدولية (GDG-G-00-02-00012-00 وEDH-A-00-07 00005-) وجاف كاليفورنيا المجلس الاستشاري للفول.

1. الطماطم نمو البادرات في القدور والصواني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفحوصات وعاء، وبذور الطماطم مصنع في وعاء واحد في العضوية في التربة الغنية مثل مزيج الشمس المشرقة. المحافظة في دفيئة في 22-28 درجة مئوية. بعد الإنبات، وتسميد مرة في الأسبوع مع المعجزة، جرو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نحو أسبوعين من الإنبات، في مرحلة صحيح أوراق اثنين، وزرع الشتلات بشكل فردي في قدور (10 سم وقطرها 17 سم العميق) مليئة التربة الرملية العقيمة التي تحتوي على الرمل 90٪ و 10٪ المزيج العضوي. إضافة Osmocote بطيئة الافراج الأسمدة والمحافظة في دفيئة في 22-28 درجة مئوية لمدة أسبوعين. الاستمرار في تسميد النباتات مرة واحدة في الاسبوع مع المعجزة، جرو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعالية الإنتاجية شاشات، بذور النباتات مباشرة في صواني في التربة الرملية، وتغطي علبة مع غلاف بلاستيكي حتى الإنبات والحفاظ على النحو المذكور أعلاه. بعد الإنبات، إضافة Osmocote بطيئة الافراج الأسمدة وتسميد مرة في الأسبوع مع المعجزة، جرو. </li></ol> 2. اللوبيا النمو في أكياس الشتلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sونبتت إما eeds في طبق بيتري، واصطف مع عدة طبقات من ورق Kimwipe، ونقل الحقائب إلى منفردة أو وضعها مباشرة في أخدود ورقة من الحقيبة ونامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحقائب في مجلد البلاستيك ملف معلق، واثنان في كل مجلد، وترتيب الملفات في رفوف في وضع عمودي. وضع رف في غرفة التحكم والبيئة المحافظة على درجة حرارة 25-28 درجة مئوية و 16 ساعة ضوء / 8 ح دورة الظلام. الرفوف ويمكن أيضا أن يستمر في الاحتباس الحراري، ولكن تحتاج الى احباط شديدة أو غطاء ورقة وضعت على الرف في كلا الجانبين من سيقان النبات، للحد من احتمالات التلوث الفطري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المياه في الحقائب مرة أو مرتين يوميا مع الماء التناضح العكسي. حوالي 10 إلى 14 يوما بعد الغرس وعندما يكون نظام الجذر كاف مع نصائح جذور التعليم العالي وقد وضعت (الشكل 1)، والشتلات جاهزة للتلقيح. </li></ol> 3. استخراج بيض النيماتودا استخراج هيتم تعديل GGS من الجذور المصابة من البروتوكول التي وضعتها هاسي وباركر (1973). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثلاثة أو أربعة أيام قبل التلقيح الديدان الخيطية، واستخراج بيض الديدان الخيطية الجذر عقدة من جذور الطماطم المصابة. قبل البدء في استخراج البيض، وغسل منطقة العمل جيدا مع الماء الساخن لتجنب التلوث. غسل أيضا في مياه ساخنة. خلاط، واثنين من الدلاء، ودعم شبكة سلكية، ومطرقة من المطاط، ثلاثة غرابيل من 425 و 90 و 25 فتحة ميكرون، والاسطوانة ومقص </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كومة من المناخل من أعلى إلى أسفل وفقا للترتيب التالي: 425 و 90 و 25 فتحة ميكرون. وسيتم جمع البيض على منخل ميكرون 25 في الجزء السفلي. وضع المناخل على اسلاك معتمدة في بالوعة. وضع دلو تحت اسلاك لجمع حل المدى من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قمم محطة المصابة (ق)، وتستخدم كمصدر من اللقاح، وتجاهل. إزالة بعناية النبات من وعاء. غسل جذور بواسطة غمس في دلو من البلاستيك مملوء بالماء. شطف جذور أخرى في إطار تشغيلنينغ المياه حتى يتم غسلها جزيئات التربة بعيدا عن جذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجذور مع مقص الى قطع صغيرة. التخلص من الجذر الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جذور المفروم من مصنع واحد في جرة من البلاستيك كبير مع غطاء، إضافة ما يكفي فقط 10٪ محلول التبييض لتغطية الجذور وإغلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هز الجرة التي تحتوي على الجذور لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح جرة وصب على جذور في غربال أعلى وغسل بخرطوم تعلق على فوهة التغشية. يغسل جيدا حتى تختفي كل رائحة مبيض. استخدام مطرقة على الاستفادة من الجانبين من المناخل لتجنب انسداد المسام غربال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غربال أعلى وشطف الركام في غربال الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غربال الثاني وجمع الحطام غرامة، والذي يتضمن البيض، من غربال الماضي. مع تيار لطيف من زجاجة مياه، نقل الحطام إلى جانب واحد من غربال. جمع الحطام والبيض في وعاء نظيف مع الحد الأدنى من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منخل مرة أخرى على المياه التي تم جمعها فيدلو من خلال منخل ميكرون 25 إلى جمع أي البيض التي ربما تكون قد لاذوا بالفرار. شطف جيدا بالماء، وجمع في الكأس نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حطام مصنع من الغربال العلوي واغسل كل غرابيل 3 بالماء المضغوط. لا تلمس جزء من شبكة المناخل لأنها قد تشوه حجم المسام. </li></ol> 4. بيض النيماتودا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط سلة معدنية نظيفة مع عدد قليل من طبقات من الورق Kimwipe واحتواءه على طبق بيتري الزجاج. السماح لمسافة 1 سم بين الجزء السفلي من سلة وطبق هذا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب بيض الديدان الخيطية المستخرج على ورقة في سلة الأسلاك. إضافة السائل بما فيه الكفاية بحيث يكون الجزء السفلي من سلة سلك تلامس سطح الماء ولكن لم يتم مغمورة في الماء. يغطي الجزء العلوي مع غطاء من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل يوم تحقق من تبخر الماء وإضافة بعض الماء في طبق بتري بحيث الجزء السفلي من سلة تلامس الماء. وذلك لمنع البيض من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل يوم، وجمع واثالثا الذي يحتوي على J2s من أطباق بتري في دورق. إذا لم يتم استخدامها فورا، تهوية واللقاح التي تم جمعها في درجة حرارة الغرفة باستخدام العرض الجوي مختبر أو الهواء الناتجة عن مضخة ماء. استخدام اللقاح الهوائية في غضون أيام 2. ويمكن جمع J2s من الفقس وضع على مدى فترة من 6-8 أيام. </li></ol> 5. الطماطم العدوى الجذر في القدور أو صواني والتقييم من العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ثلاثة aliquots من الديدان الخيطية التي تم جمعها لحساب عدد من J2s في شريحة العد أو طبق، وحساب متوسط ​​وتحديد حجم المطلوب للتلقيح. وعادة ما تستخدم 3000 J2s لكل مصنع في الأواني و 500 J2s عن النباتات التي تزرع في صواني الشتلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك اللقاح على لوح التحريك المغناطيسي على سرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تلقيح النباتات، وتأكد من أن تكون التربة رطبة ولكن ليس رطبة جدا. للتلقيح وعاء، وجعل ثلاثة ثقوب من عمق حوالي نصف وعاء في الرمال حول كل الطماطم نظام الجذر باستخدام قلم رصاص (الشكل 2 </قوي&gt;). تطعيم كل محطة من خلال تقديم J2s في ثلاثة ثقوب باستخدام ماصة. بعد ذلك، وتغطية الثقوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشاشات عالية الإنتاجية في الصواني، واستخدام تعديل إبرة طرف مختوم مع فتحات على الجانبين لاصق على طرف ماصة 5 مل على طول pipetter (الشكل 3) لتسليم J2s في التربة. بدلا من ذلك، يمكن تسليمها النيماتودا كما في الخطوة 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحافظة على النباتات في الدفيئة في 24-27 درجة مئوية لمدة ستة الى ثمانية اسابيع. تواصل تخصيب مرتين في الشهر مع معجزة، غرو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم العدوى، وإزالة النباتات بعناية من الأواني وغسل الجذور (كما هو موضح في الخطوة 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الجماهير الزرقاء البيض من قبل غمر جذور في 1 ملغم / لتر erioglaucine، لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جذور في المياه، وتقييم من قبل العد الجماهير البيض الملون على نظام الجذر الفردية. يمكن استخدام المكبر مكتب مضيئة للمساعدة في تصور الجماهير البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هناك حاجة النباتات لتحري المزيد من زدراسات enetic، لا قطع قمم قبل غسل جذور للتقييم. بعد تلطيخ والعد الجماهير البيض، وزرع الشتلات في العضوية في التربة، تقليم قمم بشكل كبير للحد من النتح، والحفاظ في دفيئة. </li></ol> 6. اللوبيا العدوى الجذر في الحقائب والتقييم من العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد اللقاح الخيطية ويقلب على لوح التحريك المغناطيسي كما هو موضح سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحقائب من المجلدات شنقا ومكان على سطح أفقي. تطعيم كل الحقيبة مع 1500 J2s في 5 مل. رفع الغطاء البلاستيك من الحقيبة وتوزيع الديدان الخيطية بالتساوي على سطح جذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحقائب في وضع أفقي لمدة 24 ساعة بعد التطعيم، مع تغطية ورقة الظلام لاستبعاد الضوء، ثم تعود إلى المجلدات شنقا في غرفة النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المياه والنباتات حسب الحاجة، مرة أو مرتين يوميا، مع حل هوغلاند في نصف قوة (هوغلاند وأرنون، 1950؛ الجدول رقم 1 </&gt; قوي) حتى يتم الاحتفال ردا على الأسمدة، وتعزيز عادة اخضرار أوراق الشجر وأكثر قوة نمو تبادل لاطلاق النار. وعادة ما يتم ري النباتات مع نصف قوة 3 أيام هوغلاند في صف واحد. بعد ذلك، والحفاظ على الحقائب رطبة بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 يوما تقريبا (المدى 28-35 يوما) بعد التلقيح، ويبث كل الحقيبة مع حوالي 10-20 مل من erioglaucine ملغم / لتر 75. الحفاظ على الحقائب غمرت مع الصبغة في وضع أفقي بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف الحقائب وتقييم نظم الجذرية عن طريق حساب الجماهير البيض تحت المكبر مكتب مضيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هناك حاجة النباتات فرزهم للدراسات الجينية مزيد من العمل أو التربية، وسحب بعناية الجذور من عملية الزرع، ورقة في التربة العضوية في الأواني والحفاظ على المسببة للاحتباس الحراري. </li></ol> 7. ممثل النتائج وتظهر في المراحل المناسبة من نباتات الطماطم واللوبيا عن التطعيمات الخيطية للنظامين وصفها في أرقام1 و 2. وبالإضافة إلى ذلك، تظهر أمثلة جيدة المصابة جذور الطماطم واللوبيا في أرقام 4 و 5. كما هو الحال في معظم الشاشات مقاومة المرض، فإنه من المستحسن أن تستخدم ما لا يقل عن 6-10 النباتات في التركيب الوراثي للتلقيح الخيطية لحساب متوسط ​​معدل العدوى. التباين في عدوى الديدان الخيطية بين النباتات، من النمط الجيني نفسه، يمكن تخفيض باستخدام موحدة حجم المصنع وكمية دقيقة وتسليم من اللقاح. استخدام الأدراج والحقائب نمو تمكن من فحص مئات الآلاف من النباتات في مساحة نمو صغير. الحقائب نمو تسمح أيضا سريعة وفعالة غير مدمرة تقييم التهابات الديدان الخيطية الجذر عقدة مع عدم وجود حاجة لغسل الجذور (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> الشكل 1. A 2 مصنع أسابيع اللوبيا نمت في الحقيبة وجاهزة للعقدة الجذر NEMAtode تلقيح. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> الشكل 2. لمدة ثلاثة مصنع الطماطم أسابيع جاهزة للتلقيح الخيطية الجذر العقدة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> الشكل 3. إبرة وتعديل رأس ماصة تستخدم لتلقيح عالية الإنتاجية من الديدان الخيطية. وختم الجزء السفلي من إبرة وتم حفر ثلاث مجموعات من الثقوب في إبرة باستخدام أشعة الليزر. ثم، تم لصقه على إبرة تعديل لطرف ماصة 5 مل. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> الشكل 4. نظام الجذر طماطم مصابة بعقدة الجذر الديدان الخيطية. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> الشكل 5. نظام الجذر اللوبيا مع الجماهير البيض ملطخة erioglaucine 30 يوما بعد التلقيح نمت في28 درجة مئوية.

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة لشاشة الخيطية الناجحة: إعداد اللقاح معدية للغاية واستخدام النباتات في هذه المرحلة التنموية المناسبة. معدل فقس بيض نيماتودا الجذور عقدة متغير بدرجة كبيرة ويتراوح ما بين 5 - 50٪. ولذلك للحصول على المستويات المثلى من فتحة وJ2s معدية للغاية، يجب إيلاء اهتمام وثيق لاستخراج البيض والإجراءات الفقس. وينبغي أن يتعرض البيض لتبييض لفترة زمنية الحد الأدنى، وينبغي أن تشطف التبييض بشكل جيد من خليط الجذر. عندما فقس البيض، لا ينبغي أن الطين الذي يحتوي على البيض أن يغطس في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، تجنب إراقة البيض في صحن بيتري الأساسية حيث يتم جمع الأحداث التي تحاك. طريقة واحدة لتجنب إراقة البيض أثناء عملية الفقس هو عدم إضافة الماء مباشرة إلى Kimwipe باعتبارها ورقة قد كسر. بدلا من ذلك إضافة الماء مباشرة إلى طبق بيتري. للحصول على أفضل النتائج، استخدم J2s فقست حديثا. إذا كان hatcح معدل منخفض وهناك حاجة إلى مزيد من اللقاح، يمكن تخزين J2s عند 15 درجة مئوية لفترة أطول. تدفئة اللقاح المخزنة على درجة حرارة الغرفة لإحياء الديدان الخيطية قبل التلقيح. ومع ذلك، لا تخزين J2s لفترات طويلة حتى عند 15 درجة مئوية كما J2s المتعطشة لن ​​تصيب بكفاءة. شتلة الشباب هي أفضل مرحلة تنموية لتلقيح الخيطية الجذر العقدة. ومع ذلك، هذا يجب أن يكون متوازنا مع تشكيل نظام الجذر كاف توفير أعداد كافية من نصائح جذر كنقاط دخول لJ2s. الحفاظ على أمثل حالة نمو النبات هي أيضا حاسمة بالنسبة للشاشات. تجنب الإفراط في سقي النباتات خاصة تلك التي تزرع في الحقائب. الإفراط في الري والحقائب، كما يتبين من المياه الراكدة في الجزء السفلي من الحقيبة، ويمكن أن تعزز نمو الفطريات ويقلل من صحة الجذر. مع تقييم المقايسات على حد سواء المزيد من عدوى الديدان الخيطية وحساب عدد البيض / نظام الجذر والبيض / غرام من الصحائفلا يمكن أن يؤديها ش الجذر. لفحوصات الطماطم، ويتم وزن الجذور الفردية واستخراج البيض كما هو موضح لتحضير اللقاح (القسم 3). عند معالجة عدد كبير من العينات النباتية، يمكن أن متآكلة نظم الجذور الفردية باستخدام الخلاط لاستخراج البيض. ينبغي أن يحسب عدد البيض في ما لا يقل عن 3 aliquots وحساب بيض / غرام من نظام الجذور الطازجة. لفحوصات الحقيبة، يتم سحبها نظام الجذر قبالة إدراج ورقة، وزنه، واستخراج البيض.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

الجذر عقدة الديدان الخيطية (جنس Meloidogyne) هي طفيليات مصنع تلزم. هم قارت للغاية وتعتبر واحدة من الديدان الخيطية النباتات الطفيلية الأكثر أهمية من الناحية الاقتصادية. والمجهرية للمرحلة الثانية الأحداث (J2)، molted مرة واحدة في البيض، هي المرحلة المعدية. وJ2s تفقس من البيض، والتحرك بحرية في التربة داخل الفيلم من المياه، وتحديد موقع نصائح جذر من الأنواع النباتية المناسبة. بعد اختراق جذور النبات، تهاجر نحو الاسطوانة الوعائية حيث إنشاء موقع للتغذية والشروع في تغذية باستخدام stylets بهم. ويتألف الموقع التغذية المتعددة الخلايا من خلايا عدة متعدد النوى الموسع تسمى &quot;الخلايا العملاقة التي تتكون من الخلايا التي خضعت karyokinesis (تكرار الانقسام) من دون الانقسام السيتوبلازمي. محيط بالدائرة الخلايا المجاورة تقسيم وتكبير حجمها مما يؤدي إلى مرارة نموذجي أو عقدة الجذر، الأعراض المميزة للعدوى الديدان الخيطية الجذر العقدة. مرة واحدة يبدأ التغذية، J2s تصبح المستقرة والأمم المتحدةdergo 3 molts إضافية ليصبحوا بالغين. من الإناث البالغات يضع 150-250 بيضة في مصفوفة هلامي أو تحت سطح الجذر. من البيض J2s عدوى جديدة يفقس وتبدأ دورة جديدة. اكتمال حياة الديدان الخيطية الجذر العقدة في دورة 4-6 أسابيع في 26-28 درجة مئوية. هنا نقدم البروتوكول التقليدي لتصيب النباتات، وتزرع في القدور، مع الجذر عقدة الديدان الخيطية وطريقتين لفحوصات عالية الإنتاجية. يتم استخدام أول الإنتاجية العالية طريقة لمحطات مع البذور الصغيرة مثل الطماطم والثاني هو لمحطات مع البذور الكبيرة مثل الفول واللوبيا مشترك. بذور كبير دعم الموسعة نمو البادرات مع تكملة المغذيات الحد الأدنى. أول تجربة إنتاجية عالية وتستخدم الشتلات المزروعة في الرمال في الأدراج في حين أنه في محطات فحص 2 تزرع في الحقائب في حالة عدم وجود تربة. وتتكون الحقيبة نمو البادرات من فتيلة X 15.5 ورقة 12.5cm، مطوية على رأس لتشكيل حوض 2-CM-العميقة التي يتم وضع البذور أو الشتلات. وويرد الفتيل ورقة داخل كيس بلاستيكي شفاف. هذه الحقائب نمو السماح الملاحظة المباشرة من أعراض عدوى الديدان الخيطية، شديد القسوة، من الجذور والبيض الإنتاج الضخم، وتحت سطح الحقيبة شفافة. كلا الأسلوبين تسمح باستخدام النباتات فرزهم، بعد phenotyping، لعبور أو إنتاج البذور. ميزة إضافية لاستخدام الحقائب النمو هو الشرط مساحة صغيرة لأنه يتم تخزين الحقائب البلاستيكية في المجلدات شنقا ترتيبها في الرفوف.

Watch this Scientific Journal Video about High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp. at JoVE.com

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

وصفت طريقتين متميزة للنباتات شاشة مع الجذر عقدة الديدان الخيطية. النهج صفها تشمل عالية الإنتاجية شاشات مع الديدان الخيطية بطريقة غير تدميري وتسهيل استخدام هذه النباتات في برامج التربية.

شاشات الإنتاجية العالية والمنخفضة مع الجذر عقدة نيماتودا Meloidogyne النيابة.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.7K Views.  University of California, Riverside. وصفت طريقتين متميزة للنباتات شاشة مع الجذر عقدة الديدان الخيطية. النهج صفها تشمل عالية الإنتاجية شاشات مع الديدان الخيطية بطريقة غير تدميري وتسهيل استخدام هذه النباتات في برامج التربية.

Video: High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: عالية الإنتاجية الكمي لمستعمرة النمو والفارق الزمني

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em&gt; البروسيلا</em&gt; إصابة خلايا هيلا

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...