يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على التباين الجيني في التبريد غير الكيميائي الضوئي المتاح داخل لوحات التنوع الجيني أو مجموعات التكاثر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية فحص عدد كبير من الأنماط الجينية للتباين في التبريد غير الكيميائي الضوئي في غضون يوم واحد. يتم تقديم البروتوكول لماكس الجلايسين أو فول الصويا ، ولكن يمكن تكييفه لتحليل المساحات النباتية الأخرى التي يمكن من خلالها جمع أقراص الرفع.
بالنسبة لشخص يقوم بتنفيذ البروتوكول لأول مرة ، فإن المفتاح هو التعامل مع قرص الرفع لمنع التلف أو الإفراط في تشبع الإسفنج بالماء. للبدء ، قم بأخذ عينات من النباتات في الموقع الميداني بعد 30 يوما من الإنبات. املأ 1/3 مستوى من الماء المقطر في جميع آبار صفيحة 24 بئرا.
قم بتسمية الغطاء وجانب اللوحة باستخدام النسخ المتماثلة المراد أخذ عينات منها. امسك أصغر ورقة كاملة التوسع موجودة في الجزء العلوي من النبات مقابل سدادة مطاطية. اضغط على حفار فلين هومبولت رقم اثنين من خلال الورقة وقم بلفه لقطع قرص ، وتجنب الضلع الأوسط.
على التوالي جمع خمسة أقراص من نفس الورقة للنسخ المتماثلة التقنية. ادفع أقراص الأوراق من حفار الفلين إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام قطعة قطن وكرر ذلك لنبات مختلف من نفس النمط الوراثي. تحقق من أن جميع أقراص الأوراق تطفو في الماء.
إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتحريك أقراص الأوراق بلطف ملتصقة بجانب البئر في وضع عائم باستخدام قطعة قطن. انتقل إلى أقراص أخذ العينات من المخطط التالي. ضع الغطاء والختم بفيلم مرن شبه شفاف.
بعد الانتهاء من أخذ العينات في لوحة 24 بئر بأكملها. قم بتخزين الطبق بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة في كيس أو صندوق أو مبرد فارغ. في مساحة المختبر النظيفة، اضغط على غطاء اللوحة المختومة لإزاحة أقراص الأوراق العالقة بالغطاء أثناء النقل.
قم بفك الفيلم وإزالة الغطاء. انقل قرص ورقة من الموضع الأول من الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى صفيحة جديدة من 96 بئرا مع توجيه قرص الورقة بشكل مسطح لأسفل في أسفل البئر. قطع مرشح شفاط الأنف إلى النصف.
اغمس الفلتر الناتج في منتصف الطريق في الماء وربت على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. أدخل الفلتر في البئر باستخدام قرص الورقة للحفاظ على الرطوبة. خذ قرص ورقة ثان من الموضع الأول للوحة المكونة من 24 بئرا وضعه وجها لأسفل في الموضع التالي المتاح للوحة 96 بئرا.
اغمس النصف المتبقي من مرشح الأنف المنتج في الماء وربته على منشفة ورقية قبل إدخاله في البئر باستخدام قرص الورقة الثاني. قم بلصق الزاوية العلوية اليمنى للمساعدة في توجيه اللوحة في الظلام للتصوير. ختم لوحات مع فيلم مرن شبه شفاف ولف لوحة في رقائق الألومنيوم.
اكتب معرفات المؤامرة ومعرف اللوحة على رقائق الألومنيوم. ضع الألواح في صندوق مظلم أو خزانة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة للاسترخاء في المرحلتين الأوليين من التبريد غير الكيميائي الضوئي. استخدم فترة حضانة مظلمة طويلة مدتها ساعة واحدة قبل التصوير إذا كانت المراحل طويلة الأجل من التبريد غير الكيميائي الضوئي ذات أهمية.
قم بإعداد لوحة وهمية إضافية للتركيز أثناء التحليل عن طريق وضع قرص ورقة في كل ركن من أركان لوحة جديدة من 96 بئرا وواحدة في المنتصف. قم بتأمين أقراص الأوراق بمرشحات الأنف كما هو الحال مع الألواح السابقة ، وقم بإغلاق اللوحة ، واحتضنها في الظلام في درجة حرارة الغرفة والرطوبة النسبية بنسبة 50٪. قم بتشغيل جهاز التصوير وافتح برنامج التصوير.
انقر فوق الإعدادات متبوعة بالبروتوكول لفتح نافذة لإدخال الخطوات في بروتوكول PAM التجريبي. وضع المواصفات الفنية للآلة المتوفرة في المخطوطة. اضبط البرنامج ليبدأ بنبضة مشبعة لقياس أقصى قدر من الكفاءة الكمومية لعملية التمثيل الضوئي المتكيفة مع الظلام عن طريق إدخال 20 ثانية في الصندوق المسمى بعد تأخير.
انقر فوق المربع تطبيق النبض وأدخل 1 في المربع المعنون هذا العدد من المرات. اضبط نبضة PPFD على 6،152 ، وطول النبض على 800 مللي ثانية ، وحدد المربع التقاط صور F Prime و FM Prime مع جميع النبضات. حدد إدراج بعد لإضافة خطوة ثانية إلى البروتوكول.
أدخل 30 ثانية في المربع المعنون بعد تأخير. ثم حدد الخيار تغيير الأكتينيك وأدخل 50 في المربع المعنون Actinic PPFD لضبط شدة الضوء على الغرفة إلى 50 PPFD. انقر فوق إدراج بعد لإضافة خطوة جديدة إلى البروتوكول وأدخل 150 ثانية في المربع المعنون بعد تأخير.
حدد تطبيق النبضة وأدخل 4 في المربع المعنون هذا العدد من المرات لتطبيق نبضات القياس كل 150 ثانية أربع مرات متتالية بينما يتم تثبيت الضوء السفعي عند 50 PPFD. اضبط التأخير وشدة الضوء لكل خطوة وفقا للقيم الواردة في المخطوطة قبل حفظ البروتوكول كملف pcl في الموقع المطلوب. أطفئ الضوء وضع اللوحة الوهمية وجها لأسفل على مرحلة العينة بحيث يشير السطح المحوري للورقة إلى أعلى نحو الكاشف وأن الإسفنجة متجهة لأسفل نحو المنصة.
اضبط ارتفاع مرحلة العينة بحيث تكون أقراص الأوراق أعلى بمقدار 140 ملم من قاعدة الجهاز. انقر فوق اتصال/قطع الاتصال بكاميرا التصوير وأيقونة كاميرا الأجهزة لبدء تشغيل الكاميرا. انقر فوق رمز تألق التركيز البؤري، الذي يمثله رمز سهم أحمر اللون على الوجهين مع خطين أخضرين في القاعدة، واضبط العدسة والتعريض الضوئي لإدخال اللوحة في التركيز البؤري.
انقر فوق رمز التألق البؤري مرة أخرى لإيقاف تشغيل الضوء الوامض. العمل في الظلام ، استبدل اللوحة الوهمية باللوحة المراد تحليلها. ضعه وجها لأسفل مع الشريط الموجود في الخارج المستخدم لتوجيه الزاوية العلوية اليمنى وانقر على أيقونة كاميرا صورة الخريطة.
اضبط تعريض الصورة عن طريق فتح الفتحة أو إغلاقها حتى يتم وضع الشريط الموجود في النافذة المنبثقة في المنطقة الخضراء. انقر فوق الزر حاول مرة أخرى بعد كل ضبط لفتحة العدسة حتى يتم ضبط التعريض الضوئي بشكل صحيح ويلتقط الجهاز صورة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد تطبيق عزل الصورة لحجب إشارات الخلفية.
سيتم عرض منطقة الورقة المركزة باللون الرمادي والخلفية باللون الأزرق. حدد المساحة أو وحدات البكسل ذات الأهمية لتضمين أقراص الأوراق فقط عن طريق ضبط الرسم البياني ومستوى غاما من القائمة المنسدلة تعديل الصورة بالنقر بزر الماوس الأيمن على الصورة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد حذف التخفيضات العالية والمنخفضة لحذف المناطق المميزة باللون الأزرق الفاتح.
انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وحدد حذف الضالات لإزالة أي وحدات بكسل لا تلمس آخر ثلاث وحدات بكسل أخرى. سيتم تحليل أي مناطق على الصورة تظهر كجزر معزولة بشكل منفصل وتضمينها في إخراج البيانات النهائي. انقر فوق رمز تشغيل البروتوكول لبدء تشغيل البرنامج.
سيظهر مؤقت في أسفل الشاشة لإعلامك بالمدة المتبقية لتشغيل البروتوكول. انتظر حتى يتم الانتهاء من البروتوكول. انقر فوق ملف وحفظ باسم لحفظ البيانات كملف igr.
أغلق النافذة بالنقر على الصليب الأحمر في أعلى يمين النافذة قبل بدء لوحة عينة أخرى. لتصدير بيانات فلورة الكلوروفيل ، افتح ملف igr في برنامج التصوير وانقر فوق ملف متبوعا بتصدير إلى مجلد لإنشاء مجلد جديد يحتوي على جميع الملفات الضرورية. أظهر قياس نموذجي للتبريد غير الكيميائي الضوئي في فول الصويا المزروع في الحقل أنه بعد وميض تشبع أولي لتحديد Fv / Fm عندما تعرضت أقراص الأوراق لضوء منخفض يبلغ 50 ميكرومول لكل متر في الثانية ، كان التبريد غير الكيميائي الضوئي أقل من واحد.
علاوة على ذلك ، عند النقل إلى الضوء العالي البالغ 2000 ميكرومول لكل متر في الثانية ، زاد التبريد غير الكيميائي الضوئي إلى أقصى قيمة تبلغ أربعة بعد 15 دقيقة. أظهر قياس فاشل زيادة طفيفة في التبريد غير الكيميائي الضوئي عند النقل إلى الضوء العالي. يعد توجيه اللوحات داخل جهاز التصوير وخطة محددة بوضوح لأخذ العينات وطلاء أقراص الأوراق أمرا ضروريا لضمان ارتباط البيانات بالنمط الوراثي الصحيح.
يمكن لهذا البروتوكول تحديد تأثير المتغيرات البيئية مثل الجفاف والسفك على التبريد غير الكيميائي الضوئي أو تقييم التبريد غير الكيميائي الضوئي على مستويات مظلة مختلفة لتحسين نماذج المحاصيل.
