سيسمح هذا البروتوكول المجهري متحد البؤر بتفسير السلوك البيئي وتكيفات الطحالب الدقيقة من البيئات القاسية ذات النمو البطيء في المختبر باستخدام التألق الذاتي لأصباغها. هذه التقنية ليست غازية وتقلل من القطع الأثرية حيث لا يتم استخدام المركبات الكيميائية. إن معرفة أداء أصباغ autotrophs والنمو المقابل سيسمح بتصميم طرق التحكم التي هي أكبر اهتمام بالكهوف السياحية والمعالم المعمارية.
ابدأ في تحضير لقاح Chroothece mobilis عن طريق نقله من استزراع الآجار إلى وسط مياه البحر أو الوسط السائل SWES. حافظ على جميع الثقافات لمدة أسبوعين مع فترة تصوير داكنة فاتحة من 16 إلى 8 عند 20 درجة مئوية تحت كثافة ضوء أبيض منخفضة ودون اهتزاز حتى يتم الحصول على كثافة الخلية المطلوبة. استخدم ملليلترا واحدا من مزرعة الطور الأسي التي تحتوي على خمسة في 10 أس خلايا ثالثة لكل مليلتر كثافة خلية للتلقيح في صفيحة 24 بئرا لإجراء تجارب مختلفة.
لإعادة إنتاج تأثير الضوء أحادي اللون ، استخدم المرشح الأخضر الذي يسمح للضوء الأخضر بالمرور من 470 إلى 570 نانومتر مع ذروة عند الطول الموجي 506 نانومتر والضوء الأحمر المعدل باستخدام مرشح بين 590 و 720 نانومتر والقمم عند 678 نانومتر. تعريض ثقافات الخلايا لهذا الضوء لمدة أسبوعين. قم بتشغيل جميع مكونات مجهر المسح بالليزر متحد البؤر المقلوب بما في ذلك الليزر.
قم بتركيب الخلايا في وسط نمو SWES من كل بئر تجريبي من لوحة 24 بئرا إلى طبق سفلي زجاجي 35 ملم للتصوير. اختر الفتحة العددية 63X أو 1.30 أو هدف غمر الجلسرين NA وضع الجلسرين فوق العدسة. بعد ذلك ، ضع لوحة البئر على مرحلة المجهر لضمان عدم تحرك العينة أثناء التقاط الصورة.
توسيط العينة في مسار الضوء والتركيز على مركز الخلية عن طريق اختيار المستوى ذي الكثافة الفلورية الأعلى. بمجرد الانتهاء من ذلك ، افتح برنامج الحصول على الصور واختر XY lambda من القائمة المنسدلة في وضع الاستحواذ. حدد خط الإثارة لليزر 561 نانومتر ، وثمانية بتات من النطاق الديناميكي و 1024 × 1024 بكسل.
اجمع أطياف الانبعاث الفلوري في عرض النطاق الترددي 10 نانومتر وحجم خطوة لامدا من أربعة نانومتر ضمن نطاق 570 إلى 760 نانومتر. اضبط الثقب في وحدة هواء واحدة وقم بتشغيل عملية الاستحواذ على مسح لامدا. بعد تكرار هذه العملية في مجالات رؤية مختلفة وتحت ظروف مختلفة من الأضواء الحمراء والخضراء ، احفظ جميع البيانات.
بمجرد الحصول على مسح لامدا ، انقر فوق نافذة القياس الكمي في الجزء العلوي من البرنامج لتقييم أطياف انبعاث التألق المجمعة. انتقل إلى نافذة المشروع المفتوحة وحدد ملف XY lambda واحدا. حدد تحليل ملف التعريف المكدس في برنامج التصوير وحدد منطقة اهتمام تبلغ أربعة ميكرومتر مربع في وسط الخلية لتحليل متوسط شدة التألق.
قم بتصدير البيانات و CSV قبل تكرار العملية بخلايا مختلفة في ظل ظروف مختلفة. بعد ذلك ، افتح ملفات CSV لتحديد قمم انبعاث التألق المختلفة لجميع المناطق المقاسة ذات الاهتمام عن طريق تحديد الحد الأقصى لبيانات التألق ل phycoerythrin phycocyanobilin و C.phycocyanin و allophycocyanin و chlorophyll A على التوالي في ملف CSV. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإنشاء جدول جديد يحتوي على جميع قيم التألق القصوى التي تم الحصول عليها من كل قمة من قمم phycobiliprotein والكلوروفيل وارسم البيانات على الرسم البياني.
لوحظت اختلافات كبيرة في متوسط شدة التألق. انخفض متوسط شدة مضان phycoerythrin phycocyanobilin بشكل ملحوظ عندما تعرضت الخلايا للضوء الأخضر أحادي اللون. في المقابل ، لم يلاحظ أي فرق في الضوء الأحمر مقارنة بالتحكم.
كان للضوء الأخضر تأثير معاكس على allophycocyanin والكلوروفيل A حيث زاد متوسط شدة التألق بشكل كبير بسبب تكيف مجمعات الهوائي بسبب زيادة الكمية أو تحسين اتصال مجمعات الهوائي وغيرها. أنتج الضوء الأحمر زيادة غير كبيرة في مضان الوفيكوسيانين والكلوروفيل. لدراسة تأثير ظروف النمو المختلفة على الخلايا في المزرعة ، من الضروري إجراء القياسات بنفس إعدادات المجهر بالضبط.
من الممكن تحليل المعلمات البيئية الأخرى ذات الصلة بثقافة الكائنات ذاتية التألق ، وكذلك إشارة التألق داخل الطيف المرئي. هذه التقنية هي نهج قوي للغاية لدراسة الكائنات الحية مع العديد من أصباغ التألق الذاتي.
