Este método puede proporcionar una idea de la variación genética en el enfriamiento no fotoquímico disponible dentro de los paneles de diversidad genética o las poblaciones reproductoras. La principal ventaja de esta técnica es el potencial de examinar un gran número de genotipos para detectar variaciones en el enfriamiento no fotoquímico en un solo día. El protocolo se presenta para la glicina máxima o la soja, pero se puede adaptar para analizar otros espacios vegetales de los que se pueden recoger discos de elevación.
Para alguien que realiza el protocolo por primera vez, la clave es manejar el disco de elevación para evitar daños o esponjas sobresaturadas con agua. Para comenzar, muestree las plantas en el sitio de campo 30 días después de la germinación. Llene 1/3 de nivel de agua destilada en todos los pozos de una placa de 24 pocillos.
Etiquete la tapa y el lado de la placa con las réplicas que se van a muestrear. Sostenga la hoja más joven expandida presente en la parte superior de la planta contra un tapón de goma. Presione un barrenador de corcho de Humboldt número dos a través de la hoja y gire para cortar un disco, evitando la costilla media.
Recolectar consecutivamente cinco discos de la misma hoja para réplicas técnicas. Empuje los discos de la hoja fuera del barrenador del corcho en un solo pozo de una placa de 24 pocillos con un hisopo de algodón y repita esto para una planta diferente del mismo genotipo. Compruebe que todos los discos de hojas estén flotando en el agua.
De lo contrario, mueva suavemente los discos de las hojas pegados al costado de un pozo en una posición flotante con un hisopo de algodón. Pase a los discos de muestreo de la siguiente gráfica. Coloque la tapa y el sello con una película flexible semitransparente.
después de completar el muestreo en toda la placa de 24 pocillos. Guarde el plato fuera de la luz solar directa en una bolsa, caja o refrigerador vacío. En un espacio de laboratorio limpio, toque la tapa de la placa sellada para desalojar los discos de hojas pegados a la tapa durante el transporte.
Desenvuelva la película y retire la tapa. Transfiera un disco de hoja desde la primera posición de la placa de 24 pocillos a una placa fresca de 96 pocillos con el disco de hoja mirando hacia abajo en la parte inferior del pozo. Corte un filtro aspirador nasal por la mitad.
Sumerja el filtro resultante hasta la mitad en agua y aplique una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Inserte el filtro en el pozo con el disco de la hoja para mantener la humedad. Tome un segundo disco de hoja de la primera posición de la placa de 24 pocillos y colóquelo boca abajo en la siguiente posición disponible de la placa de 96 pocillos.
Sumerja la mitad restante del filtro nasal producido en agua y aplíquelo en una toalla de papel antes de insertarlo en el pozo con el segundo disco de hoja. Pega con cinta adhesiva la esquina superior derecha para ayudar a orientar la placa en la oscuridad para obtener imágenes. Selle las placas con una película flexible semitransparente y envuelva la placa en papel de aluminio.
Escriba los ID de la trama y la identificación de la placa en el papel de aluminio. Coloque las placas en una caja oscura o gabinete durante un mínimo de 30 minutos para la relajación de las dos primeras fases de enfriamiento no fotoquímico. Use un período prolongado de incubación oscura de una hora antes de la toma de imágenes si las fases a largo plazo de enfriamiento no fotoquímico son de interés.
Prepare una placa ficticia adicional para enfocar durante el análisis colocando un disco de hoja en cada esquina de una placa fresca de 96 pocillos y una en el centro. Asegure los discos de las hojas con filtros nasales como se hizo con las placas anteriores, selle la placa e incube en la oscuridad a temperatura ambiente y 50% de humedad relativa. Encienda el generador de imágenes y abra el software de imágenes.
Haga clic en Configuración seguido de Protocolo para abrir una ventana para la entrada de pasos en el protocolo experimental PAM. Establezca las especificaciones técnicas de la máquina proporcionadas en el manuscrito. Configure el programa para que comience con un pulso saturado para medir la máxima eficiencia cuántica de la fotosíntesis adaptada a la oscuridad ingresando 20 segundos en la caja llamada Después de un retraso de.
Haga clic en el cuadro Aplicar pulso e introduzca 1 en el cuadro titulado Este número de veces. Establezca el PPFD de pulso en 6, 152, la longitud del pulso en 800 milisegundos y marque la casilla Tomar imágenes principales F y FM con todos los pulsos. Marque Insertar después para agregar un segundo paso al protocolo.
Introduzca 30 segundos en el cuadro titulado Después de un retraso de. Luego, seleccione la opción Cambiar actínico e ingrese 50 en el cuadro titulado PPFD actínico para establecer la intensidad de la luz en la cámara a 50 PPFD. Haga clic en Insertar después para agregar un nuevo paso al protocolo e introduzca 150 segundos en el cuadro titulado Después de un retraso de.
Seleccione Aplicar pulso e ingrese 4 en el cuadro titulado Este número de veces para aplicar pulsos de medición cada 150 segundos cuatro veces seguidas mientras la luz actínica se mantiene a 50 PPFD. Ajuste el retardo y la intensidad de la luz para cada paso de acuerdo con los valores proporcionados en el manuscrito antes de guardar el protocolo como un archivo pcl en la ubicación deseada. Apague la luz y coloque la placa ficticia boca abajo en el escenario de la muestra para que la superficie adaxial de la hoja apunte hacia el detector y que la esponja esté mirando hacia abajo hacia la plataforma.
Ajuste la altura del escenario de muestra de modo que los discos de hoja estén 140 milímetros por encima de la base del instrumento. Haga clic en el icono conectar/desconectar a la cámara del generador de imágenes y la cámara de hardware para iniciar la cámara. Haga clic en el símbolo de fluorescencia de enfoque, representado por un icono de flecha de dos lados de color rojo con dos líneas verdes en la base, y ajuste la lente y la exposición para enfocar la placa.
Haga clic de nuevo en el icono de fluorescencia de enfoque para apagar la luz intermitente. Trabajando en la oscuridad, reemplace la placa ficticia con la placa a analizar. Colóquelo boca abajo con la cinta en el exterior utilizada para orientar la esquina superior derecha y haga clic en el icono de la cámara de imagen de mapa.
Ajuste la exposición de la imagen abriendo o cerrando la abertura hasta que la barra de la ventana emergente se coloque en la zona verde. Haga clic en el botón Volver a intentarlo después de cada ajuste de la apertura hasta que la exposición se ajuste correctamente y el instrumento tome una imagen. Haga clic derecho en la imagen y seleccione Aplicar aislamiento de imagen para bloquear las señales de fondo.
El área de la hoja enfocada se mostrará en gris y el fondo en azul. Seleccione el área o los píxeles de interés para incluir solo los discos de hoja ajustando el histograma y el nivel gamma en el menú desplegable Modificar imagen haciendo clic con el botón derecho en la imagen. Haga clic derecho en la imagen y seleccione Eliminar cortes altos y bajos para eliminar las áreas resaltadas de color azul claro.
Haga clic derecho en la imagen y seleccione Eliminar extravíos para eliminar cualquier píxel que no toque los últimos tres píxeles. Cualquier área de la imagen que aparezca como islas aisladas se analizará por separado y se incluirá en la salida de datos final. Haga clic en el icono ejecutar protocolo para iniciar el programa.
Aparecerá un temporizador en la parte inferior de la pantalla que le informará cuánto tiempo le queda por ejecutar el protocolo. Espere hasta que finalice el protocolo. Haga clic en Archivo y Guardar como para guardar los datos como un archivo igr.
Cierre la ventana haciendo clic en la cruz roja en la parte superior derecha de la ventana antes de comenzar otra placa de muestra. Para exportar los datos de fluorescencia de clorofila, abra el archivo igr en el software de imágenes y haga clic en Archivo seguido de Exportar a carpeta para crear una nueva carpeta con todos los archivos necesarios. Una medición típica del enfriamiento no fotoquímico en soja cultivada en campo mostró que después de un destello de saturación inicial para determinar Fv / Fm cuando los discos de hoja se expusieron a poca luz de 50 micromoles por metro por segundo, el enfriamiento no fotoquímico fue inferior a uno.
Además, al transferirse a alta luz de 2.000 micromoles por metro por segundo, el enfriamiento no fotoquímico aumentó hasta el valor máximo de cuatro después de 15 minutos. Una medición fallida mostró un aumento mínimo en el enfriamiento no fotoquímico al transferirse a alta luz. La orientación de las placas dentro del generador de imágenes y un plan claramente definido para el muestreo y el recubrimiento de los discos de hojas es esencial para garantizar que los datos estén vinculados al genotipo correcto.
Este protocolo puede cuantificar el impacto de variables ambientales como la sequía y el desprendimiento en el enfriamiento no fotoquímico o evaluar el enfriamiento no fotoquímico en diferentes niveles de dosel para refinar los modelos de cultivo.
