يسمح هذا البروتوكول بتوصيل المجالات الكهربائية النبضية بواسطة الإلكترونيات المرنة لدراسة آثارها العلاجية على الورم الأرومي الدبقي. نقوم بذلك عن طريق تصور البيئة المكروية للورم في الجسم الحي مع التصوير. يتم دمج الإلكترونيات الحيوية في هذا البروتوكول باستخدام عدة نماذج مختلفة من التعقيد المتزايد من أجل دراسة تأثير الحقول النابضة على السرطان.
يمكن أيضا اختبار تقنيات التصنيع الدقيق المقدمة في هذا العمل كوسيلة لعلاج أنواع أخرى من السرطانات بما في ذلك الطعوم الخارجية المشتقة من المريض. هذا يتحرك نحو فكرة الطب الدقيق المصمم لكل مريض على حدة. هذه المجسات مصنوعة من تقنيات التصنيع الدقيق القياسية ، وبالتالي فإن التصنيع واضح ومباشر ويمكن لأي شخص لديه غرفة نظيفة صنعها.
لنقش القطب الذهبي ، قم بإيداع طبقة ثلاثة ميكرومتر من الباريلين C مع نظام ترسيب الباريلين عن طريق وضع الشرائح الزجاجية النظيفة في غرفة الترسيب. قم بوزن ستة جرامات من الباريلين C في قارب من الألومنيوم ، وضعه في الفرن ، وإخلاء الماكينة ، وابدأ الترسيب بالمعلمات الموضحة في المخطوطة. عند الانتهاء من الترسيب ودرجة حرارة المرذاذ أقل من 40 درجة مئوية ، قم بإيقاف تشغيل المبرد والمبخر والفرن.
تنفيس الجهاز وجمع العينات. قم بلف العينات المعالجة بالبلازما بمقاومة ضوئية سلبية عند 1،000 مرة G لمدة 40 ثانية. كشف مقاوم الضوء من خلال قناع يتميز بتصميم القطب المرقم.
ثم اغمر العينات في مطور معدني خال من الأيونات لمدة ثلاث دقائق لإزالة مقاومة الضوء غير المكشوفة. لإيداع طبقة التصاق 20 نانومتر من الكروم وطبقة 300 نانومتر من الذهب مع مبخر حراري ، قم بتنفيس آلة المبخر وقص العينات على اللوحة المستديرة العلوية بمسامير معدنية. املأ البوتقات المخصصة على التوالي بالكروم والذهب.
قم بإغلاق الماكينة وإخلائها وابدأ دوران حامل العينة. حدد البوتقة التي تحتوي على الكروم وقم بزيادة التيار ببطء حتى يصل معدل الترسيب إلى 0.2 أنغستروم في الثانية. افتح الغالق ، وانتظر حتى ترسب 20 نانومتر من الكروم ، وأغلق الغالق ، وقم بخفض التيار ببطء حتى صفر مللي أمبير.
حدد بوتقة تحتوي على الذهب وقم بزيادة التيار ببطء حتى معدل ترسيب 0.2 أنجستروم في الثانية. افتح الغالق لتبخير الذهب ، وانتظر حتى ترسب 10 نانومتر من الذهب ، ثم قم بزيادة معدل الترسيب إلى 1.5 أنغستروم في الثانية حتى يتم ترسيب 300 نانومتر تقريبا. أغلق الغالق وقم بخفض التيار ببطء إلى صفر مللي أمبير.
اغمر العينات في كأس زجاجية تحتوي على الأسيتون. ثم شطف العينات مع الأيزوبروبانول وتجفيفها بمسدس هوائي. قم بتغطية أربع طبقات من محلول PEDOT: PSS عند 150 مرة G لمدة 35 ثانية.
قم بإزالة طبقة الباريلين C القربانية عن طريق غمر العينات في الماء. اغمر العينات في ماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة لإزالة الصابون المتبقي والمركبات منخفضة الوزن الجزيئي في فيلم PEDOT: PSS وفصل العينات عن الركيزة الزجاجية. أضف 75 ميكرولترا من محلول الأغاروز المنصهر 1٪ في كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا بعناية واتركها تصلب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
افصل خلايا الورم الأرومي الدبقي المحول التي تم الحصول عليها أثناء توليد خط الخلية المستقر. أضف 10،000 خلية ورم أرومي دبقي لكل بئر وتشكل الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر لكل بئر باستخدام DMEM يحتوي على جرام واحد لكل لتر جلوكوز ، L-glutamine ، بيروفات الصوديوم ، وبيكربونات الصوديوم ، مصل بقري جنيني 10٪ ، 100 وحدة لكل ميكرولتر من البنسلين ، و 100 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الستربتومايسين. استبدل نصف الوسائط بوسائط جديدة كل يومين حتى يتم إجراء مزيد من التجارب مع الاحتفاظ بطرف الماصة في الجزء العلوي من البئر لتجنب تلف الأغاروز أو الكروي نفسه.
ضع البيض المخصب للسمان الياباني ، Coturnix japonica ، في حاضنة على صواني مع دوار أوتوماتيكي يحول البيض كل ساعتين. يعتبر هذا اليوم يوم جنيني صفر. في اليوم الجنيني الثالث ، افتح البيض برفق باستخدام ملقط بأطراف رفيعة مغسولة مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
صب الجنين في وعاء وزن بلاستيكي ، وقم بتغطيته بقارب وزن آخر وضعه في حاضنة مرطبة قياسية عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الجنيني السادس، قم بعمل شق صغير في الغشاء المشيمي الولعي بإبرة قياس 23. ضع كرويا لمدة سبعة أيام على الشق باستخدام ماصة وأعد الجنين إلى الحاضنة لمدة ثلاثة أيام حتى مزيد من التجارب.
ضع قطرة من DPBS لتغطية حج القحف. ضع القطب المرن على قطرة DPBS وضع الجزء الخلفي من المسبار برفق مع وسادات التلامس على ظهر الماوس. قم بامتصاص قطرة DPBS بقطعة صغيرة من الورق حتى يتمكن المسبار من الاستلقاء على الجافية ومتابعة انحناء الدماغ ، مما يضمن بقاء الطبقة الصغيرة من المحلول الملحي أسفل الأقطاب الكهربائية لتعمل كحاجز ضد تسرب الغراء.
ضع قطرة صغيرة من لاصق السيليكون على المسبار وقم بتغطيته بغطاء زجاجي دائري خمسة ملليمترات. ادفع زجاج الغطاء لأسفل حتى يتم توزيع السيليكون بالتساوي وتكون المسافة بين زجاج الغطاء والمسبار ضئيلة. ثم انتظر 30 ثانية حتى يتجمد السيليكون.
لتأمين زجاج الغطاء ، ضع الغراء الفائق بسرعة على جوانبه وادفعه لأسفل حتى يصبح الغراء صلبا. ضع الغراء الفائق على عنق المسبار باستخدام عود أسنان مع الحرص على سحب الغراء الفائق أسفل الرقبة لتوفير دعم ثابت. تغطية الجمجمة بأسمنت الأسنان لبناء غطاء مزمن والحرص بشكل خاص على تغطية حواف الغطاء الزجاجي فقط.
ارفع الجزء الخلفي من المسبار وضع الأسمنت أسفل عنق المسبار. بقية المسبار على الأسمنت قبل أن يعالج. ادفع عنق المسبار لأسفل برفق لوضع سطحه في نفس مستوى زجاج الغطاء وليس في طريق هدف المجهر أثناء التجربة.
قم بتغطية الجزء العلوي من عنق المسبار بما لا يزيد عن 1.5 ملم من طبقة الأسمنت السنية لتحقيق قبضة قوية على المسبار. قم ببناء بئر أسمنت يقدم سلسلة من التلال بطول 1.5 ملم على ارتفاع متر إلى ملليمترين حول زجاج الغطاء لإنشاء حوض لسائل الغمر لتصوير الفوتونين. بعد علاج الأسمنت ، قم بإدارة التسكين بعد الجراحة وحافظ على دفء الحيوان حتى الشفاء عن طريق لفه في منشفة ورقية ووضعه بالقرب من مصباح الأشعة تحت الحمراء.
تظهر الأقطاب الكهربائية المطلية ب PEDOT: PSS المناطق النموذجية التي تهيمن عليها السعة والمقاومة مفصولة بتردد قطع ، بينما تعرض الأقطاب الكهربائية غير المطلية سلوكا سعويا فقط. كشف نمو الكرويات التي لوحظت باستخدام مجهر برايت فيلد أن هناك حاجة إلى يومين أو ثلاثة أيام على الأقل للحصول على كرويات كروية وكثيفة اعتمادا على خط الخلية وعدد الخلايا المصنفة. في نموذج البويضة ، يمكن تقييم طعم الأجسام الكروية في الغشاء المشيمي الولعي بواسطة الفحص المجهري الفلوري لأن الخلايا الحية تحتوي على الكالسيوم داخل الخلايا ويمكن تقييم الأوعية الدموية للورم عن طريق حقن صبغة فلورية في الأوعية الدموية.
بالمقارنة مع المعاوقة في محلول ملحي ، من المتوقع زيادة المعاوقة في الجسم الحي عند ترددات أعلى من 100 هرتز بسبب وجود بيئة بيولوجية. يمكن ملاحظة الحمة العصبية الوعائية وتسلل الورم وتمييزها من خلال الركيزة الشفافة على مدى أسابيع بواسطة مجهرين فوتونين. يمكن أن يظهر استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في الخلايا ذات الأهمية الحد الأدنى من العملية الالتهابية التي يسببها زرع القطب وحده.
يمكن أن تظهر وجود الخلايا الدبقية الصغيرة والوحيدات بعد 26 يوما من زرع الحقول الكهربائية النبضية حفز القطب. تم العثور على كل من الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الأحادية المحيطية والخلايا الدبقية الصغيرة الرنانة في الدماغ حول الورم وداخله. النقطة الحاسمة للنجاح في إجراء الزرع هي ضمان إحكام غلق وتسطيح نافذة الجمجمة وتحسين جودة التلامس مع المسبار.
بالإضافة إلى التصوير داخل الجسم ، ما يمكن أن يعتبر الجمع بين بروتوكولنا ومقاييس وتقنيات أخرى مثل أخذ العينات ومقاييس عمل الدم للسيتوكينات ، والحالة المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، أو حتى التحليل السلوكي. يمهد هذا العمل الطريق لاستخدام الأجهزة المرنة القابلة للزرع للسرطان ويفتح آفاقا جديدة لاستخدام الطب الإلكتروني الحيوي لهذا المرض المزمن.
