이 프로토콜은 교모세포종에 대한 치료 효과를 연구하기 위해 유연한 전자 장치에 의한 펄스 전기장의 전달을 허용합니다. 우리는 이미징을 통해 생체 내 종양 미세 환경을 시각화하여 이를 수행합니다. 생체 전자 공학은 맥동 필드가 암에 미치는 영향을 연구하기 위해 복잡성이 증가하는 여러 모델을 사용하여 이 프로토콜에 통합됩니다.
이 연구에서 제시된 미세 가공 기술은 환자 유래 이종 이식편을 포함한 다른 유형의 암을 치료하는 수단으로도 테스트 할 수 있습니다. 이것은 각 개별 환자에 맞는 정밀 의학의 아이디어로 이동합니다. 이 프로브는 표준 미세 가공 기술로 만들어지므로 제조가 간단하며 클린룸만 있으면 누구나 만들 수 있습니다.
금 전극 패터닝을 위해, 깨끗한 유리 슬라이드를 증착 챔버에 배치함으로써 파릴렌 증착 시스템으로 3 마이크로미터 층의 파릴렌 C를 증착한다. 알루미늄 보트에서 6 그램의 파릴 렌 C의 무게를 측정하고, 용광로에 넣고, 기계를 비우고, 원고에 설명 된 매개 변수로 증착을 시작하십시오. 증착이 완료되고 기화기 온도가 섭씨 40도 미만이면 냉각기, 기화기, 용광로를 끕니다.
기계를 환기시키고 샘플을 수집하십시오. 플라즈마 처리된 샘플을 40초 동안 1, 000배 G에서 네거티브 포토레지스트로 스핀 코팅합니다. interdigitated 전극 디자인이 특징인 마스크를 통해 포토레지스트를 노출시킵니다.
그런 다음 샘플을 금속 이온이 없는 현상액에 3분 동안 담그고 비노광 포토레지스트를 제거합니다. 열 증발기로 20 나노 미터의 크롬 접착 층과 300 나노 미터의 금 층을 증착하려면 증발기 기계를 환기시키고 금속 나사로 상부 원형 판에 샘플을 클립합니다. 전용 도가니를 각각 크롬과 금으로 채웁니다.
기계를 밀봉하고 비우고 샘플 홀더의 회전을 시작합니다. 크롬이 포함된 도가니를 선택하고 증착 속도가 초당 0.2옹스트롬에 도달할 때까지 전류를 천천히 증가시킵니다. 셔터를 열고 20나노미터의 크롬이 증착될 때까지 기다렸다가 셔터를 닫고 0밀리암페어가 될 때까지 전류를 천천히 낮춥니다.
도가니가 포함된 금을 선택하고 초당 0.2옹스트롬의 증착 속도가 될 때까지 전류를 천천히 증가시킵니다. 셔터를 열어 금을 증발시키고 10나노미터의 금이 증착될 때까지 기다린 다음 약 300나노미터가 증착될 때까지 증착 속도를 초당 1.5옹스트롬으로 높입니다. 셔터를 닫고 전류를 0밀리암페어로 천천히 낮춥니다.
아세톤이 들어있는 비커에 샘플을 담그십시오. 그런 다음 샘플을 이소프로판올로 헹구고 에어건으로 건조시킵니다. PEDOT:PSS 용액의 4층을 150배 G에서 35초 동안 스핀 코팅합니다.
샘플을 물에 침지하여 희생 파릴렌 C 층을 제거합니다. 샘플을 탈 이온수에 30 분 동안 담그면 pedot : pss 필름에 남아있는 비누와 저 분자량 화합물을 제거하고 유리 기판에서 샘플을 분리합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 75마이크로리터의 용융된 1% 아가로스 용액을 조심스럽게 첨가하고 실온에서 15분 동안 응고시킨다.
안정한 세포주 생성 동안 얻어진 형질도입된 교모세포종 세포를 분리한다. 10, 000 교모세포종 세포를 웰 당 첨가하고 리터당 1그램 포도당, L-글루타민, 나트륨 피루브산 및 중탄산나트륨, 10% 태아 소 혈청, 페니실린의 마이크로리터당 100 단위 및 스트렙토마이신의 마이크로리터당 100 마이크로그램을 포함하는 DMEM을 사용하여 웰 당 150 마이크로리터에 총 부피를 구성한다. 추가 실험이 있을 때까지 배지의 절반을 새 배지로 교체하고 피펫 팁을 웰 상부에 유지하여 아가로스 또는 스페로이드 자체의 손상을 방지합니다.
일본 메추라기 인 Coturnix japonica의 수정란을 2 시간마다 알을 돌리는 자동 회전자가있는 트레이의 인큐베이터에 넣습니다. 이 날은 배아 0 일로 간주됩니다. 배아 3일째에 70% 에탄올로 미리 세척한 얇은 팁이 있는 핀셋을 사용하여 알을 부드럽게 엽니다.
배아를 플라스틱 계량 보트에 붓고 다른 계량 보트로 덮고 섭씨 37도의 표준 가습 인큐베이터에 3일 동안 넣습니다. 배아 6일째에 23게이지 바늘로 융모막 막을 작게 절개합니다. 피펫을 사용하여 절개 부위에 7일 스페로이드를 놓고 추가 실험이 있을 때까지 3일 동안 배아를 인큐베이터로 되돌립니다.
개두술을 덮기 위해 DPBS 한 방울을 떨어뜨립니다. 유연한 전극을 DPBS 드롭에 놓고 접촉 패드가 있는 프로브 뒷면을 마우스 뒷면에 부드럽게 놓습니다. 프로브가 경막에 평평하게 놓일 수 있을 때까지 작은 종이 조각으로 DPBS 방울을 흡수하고 뇌의 곡률을 따라 작은 식염수 층이 전극 아래에 남아 접착제 유출에 대한 장벽 역할을 하도록 합니다.
실리콘 접착제를 프로브에 작은 방울로 떨어뜨리고 5mm 원형 커버 유리로 덮습니다. 실리콘이 고르게 분포되고 커버 유리와 프로브 사이의 거리가 최소화될 때까지 커버 유리를 아래로 누릅니다. 그런 다음 실리콘이 굳을 때까지 30초 동안 기다립니다.
커버 유리를 고정하려면 측면에 초강력 접착제를 빠르게 바르고 접착제가 단단해질 때까지 아래로 누릅니다. 이쑤시개를 사용하여 프로브의 목에 슈퍼 접착제를 바르고 슈퍼 접착제가 목 아래로 당겨져 안정적인 지지를 제공합니다. 두개골을 치과용 시멘트로 덮어 만성 캡을 만들고 커버 유리의 가장자리만 덮도록 각별히 주의하십시오.
프로브 뒷면을 들어 올리고 프로브 목 아래에 시멘트를 바릅니다. 경화되기 전에 시멘트에 프로브의 나머지 부분을 올려줍니다. 프로브의 목을 부드럽게 아래로 눌러 표면을 커버 유리와 같은 높이에 놓고 실험 중에 현미경 대물렌즈를 방해하지 않도록 합니다.
프로브를 단단히 고정하기 위해 프로브 넥의 상단을 1.5mm 이하의 치과용 시멘트 층으로 덮습니다. 커버 유리 주위 1-2mm에 1.5mm 융기를 나타내는 시멘트 우물을 만들어 2광자 이미징을 위한 침지 유체를 위한 분지를 만듭니다. 시멘트가 경화 된 후 수술 후 진통제를 투여하고 종이 타월로 싸서 적외선 전구 가까이에 두어 회복 될 때까지 동물을 따뜻하게 유지하십시오.
pedot:pss 코팅 전극은 차단 주파수로 분리된 일반적인 용량성 및 저항성 지배 영역을 나타내는 반면, 코팅되지 않은 전극은 용량성 거동만 표시합니다. 명시야 현미경으로 관찰한 스페로이드의 성장은 세포주와 파종된 세포의 수에 따라 구형 및 조밀한 스페로이드를 얻는 데 최소 2-3일이 필요하다는 것을 보여주었습니다. in ovo 모델에서 융모막 막의 스페로이드 이식편은 살아있는 세포가 세포 내 칼슘을 가지고 있고 형광 염료를 혈관에 주입하여 종양의 혈관 형성을 평가할 수 있기 때문에 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다.
식염수 중의 임피던스와 비교하여, 생물학적 환경의 존재로 인해 100 헤르츠 이상의 주파수에서 생체 내에서 임피던스의 증가가 예상된다. 혈관화된 신경 실질 및 종양 침윤은 2개의 광자 현미경에 의해 수주에 걸쳐 투명 기질을 통해 관찰 및 특성화될 수 있다. 관심 세포에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 동물의 사용은 전극 이식 단독으로 유도되는 최소 염증 과정을 입증할 수 있습니다.
그것은 미세아교세포와 단핵구의 존재를 보여줄 수 있습니다 이식 후 26일 펄스 전기장 자극 전극. 말초 단핵구 유래 세포와 뇌 공명 소교 세포가 모두 종양 주변과 내부에서 발견되었습니다. 임플란트 시술의 성공을위한 중요한 점은 두개골 창의 밀봉 및 평탄도를 보장하고 프로브와의 접촉 품질을 최적화하는 것입니다.
생체 내 이미징 외에도 사이토카인에 대한 혈액 작업의 샘플링 및 측정, 유세포 분석에 의한 면역 상태 또는 행동 분석과 같은 다른 측정 및 기술과 우리의 프로토콜을 결합하는 것을 고려할 수 있습니다. 이 연구는 암에 대한 유연한 이식형 장치의 사용을 위한 길을 열어주고 이 만성 질환에 대한 생체 전자 의학의 사용에 대한 새로운 전망을 열어줍니다.
