Этот протокол позволяет доставлять импульсные электрические поля с помощью гибкой электроники для изучения их терапевтического воздействия на глиобластому. Мы делаем это, визуализируя микроокружение опухоли in vivo с помощью визуализации. Биоэлектроника интегрируется в этот протокол, используя несколько различных моделей возрастающей сложности, чтобы изучить влияние пульсирующих полей на рак.
Методы микрофабрикации, представленные в этой работе, также могут быть протестированы в качестве средства лечения других типов рака, включая ксенотрансплантаты, полученные от пациентов. Это движется к идее точной медицины, адаптированной к каждому отдельному пациенту. Эти зонды изготавливаются с использованием стандартных технологий микрообработки, поэтому производство простое, и их может изготовить любой, у кого есть чистая комната.
Для нанесения рисунка на золотых электродах нанесите трехмикрометровый слой парилена C с помощью системы париленового осаждения, поместив чистые предметные стекла в камеру осаждения. Взвесьте шесть граммов парилена С в алюминиевой лодке, поместите его в печь, откачайте машину и начните осаждение с параметрами, описанными в рукописи. Когда осаждение закончится и температура испарителя будет ниже 40 градусов по Цельсию, выключите чиллер, испаритель, печь.
Проветрите машину и соберите образцы. Отжим покрывают обработанные плазмой образцы негативным фоторезистом при 1 000 раз G в течение 40 секунд. Экспонируйте фоторезист через маску с межпальцевым электродом.
Затем погрузите образцы в проявитель, не содержащий ионов металлов, на три минуты, чтобы удалить неэкспонированный фоторезист. Чтобы нанести 20-нанометровый адгезионный слой хрома и 300-нанометровый слой золота с помощью термоиспарителя, выпустите вентиляционную машину и закрепите образцы на верхней круглой пластине металлическими винтами. Наполните специальные тигли соответственно хромом и золотом.
Запечатайте и опорожните машину и начните вращение держателя образца. Выберите тигель, содержащий хром, и медленно увеличивайте ток, пока скорость осаждения не достигнет 0,2 ангстрема в секунду. Откройте затвор, дождитесь осаждения 20 нанометров хрома, закройте затвор и медленно снижайте ток до нуля миллиампер.
Выберите золотосодержащий тигель и медленно увеличивайте ток до скорости осаждения 0,2 ангстрема в секунду. Откройте затвор, чтобы испарить золото, дождитесь осаждения 10 нанометров золота, а затем увеличьте скорость осаждения до 1,5 ангстрема в секунду, пока не будет осаждено примерно 300 нанометров. Закройте затвор и медленно уменьшите ток до нуля миллиампер.
Погрузите образцы в стакан, содержащий ацетон. Затем промойте образцы изопропанолом и высушите их с помощью пневматического пистолета. Нанесите четыре слоя раствора PEDOT:PSS в 150 раз G в течение 35 секунд.
Удалите жертвенный слой парилена C, погрузив образцы в воду. Погрузите образцы в деионизированную воду на 30 минут, чтобы удалить остатки мыла и низкомолекулярных соединений в пленке PEDOT:PSS, и отделите образцы от стеклянной подложки. Осторожно добавьте 75 микролитров расплавленного 1%-ного раствора агарозы в каждую лунку 96-луночной пластины и дайте ему застыть в течение 15 минут при комнатной температуре.
Отделяют трансдуцированные клетки глиобластомы, полученные во время генерации стабильной клеточной линии. Добавьте 10 000 клеток глиобластомы на лунку и получите общий объем до 150 микролитров на лунку, используя DMEM, содержащий один грамм на литр глюкозы, L-глютамина, пирувата натрия и бикарбоната натрия, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 единиц на микролитр пенициллина и 100 микрограммов на микролитр стрептомицина. Заменяйте половину среды свежей средой каждые два дня до дальнейших экспериментов, сохраняя наконечник пипетки в верхней части лунки, чтобы избежать повреждения агарозы или самого сфероида.
Поместите оплодотворенные яйца японского перепела, Coturnix japonica, в инкубатор на лотки с автоматическим ротатором, который переворачивает яйца каждые два часа. Этот день считается нулевым эмбриональным днем. На третий эмбриональный день аккуратно откройте яйца с помощью пинцета с тонкими кончиками, предварительно промытыми 70%-ным этанолом.
Вылейте эмбрион в пластиковую лодку для взвешивания, накройте ее другой лодкой для взвешивания и поместите в стандартный увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на три дня. На шестой день эмбриона сделайте небольшой разрез в хориоаллантоисной оболочке иглой 23 калибра. Поместите семидневный сфероид на разрез с помощью пипетки и верните эмбрион в инкубатор на три дня до дальнейших экспериментов.
Поместите каплю DPBS, чтобы покрыть трепанацию черепа. Поместите гибкий электрод на каплю DPBS и аккуратно поместите заднюю часть зонда с контактными площадками на спину мыши. Поглотите каплю DPBS небольшим листом бумаги до тех пор, пока зонд не сможет лечь на твердую мозговую оболочку и следить за кривизной мозга, следя за тем, чтобы небольшой слой физиологического раствора оставался под электродами, чтобы действовать как барьер против утечки клея.
Нанесите небольшую каплю силиконового клея на зонд и накройте его пятимиллиметровым круглым покровным стеклом. Надавите на покровное стекло до тех пор, пока силикон не распределится равномерно, а расстояние между покровным стеклом и зондом не станет минимальным. Затем подождите 30 секунд, пока силикон затвердеет.
Чтобы закрепить покровное стекло, быстро нанесите суперклей на его бока и надавите до тех пор, пока клей не станет твердым. Нанесите суперклей на горловину зонда с помощью зубочистки, следя за тем, чтобы суперклей попал под шею, чтобы обеспечить стабильную поддержку. Покройте череп зубным цементом, чтобы создать хронический колпачок, и будьте особенно осторожны, чтобы покрыть только края покровного стекла.
Поднимите заднюю часть зонда и нанесите цемент под горловину зонда. Оставшуюся часть зонда нанесите на цемент до того, как он затвердеет. Осторожно надавите на горловину зонда, чтобы его поверхность находилась на том же уровне, что и покровное стекло, а не на пути объектива микроскопа во время эксперимента.
Покройте верхнюю часть горловины зонда не более чем 1,5 миллиметрами слоя стоматологического цемента, чтобы обеспечить надежную фиксацию зонда. Постройте цементный колодец, представляющий собой 1,5-миллиметровый гребень на один-два миллиметра вокруг покровного стекла, чтобы создать бассейн для погружной жидкости для двухфотонной визуализации. После того, как цемент затвердеет, нанесите послеоперационную анальгезию и держите животное в тепле до выздоровления, завернув его в бумажное полотенце и поместив рядом с инфракрасной лампочкой.
Электроды с покрытием PEDOT: PSS демонстрируют типичные емкостные и резистивные области, разделенные частотой среза, тогда как электроды без покрытия демонстрируют только емкостное поведение. Рост сфероидов, наблюдаемый с помощью светлопольного микроскопа, показал, что для получения сферических и плотных сфероидов требуется не менее двух-трех дней в зависимости от клеточной линии и количества засеянных клеток. В модели in ovo трансплантат сфероидов в хориоаллантоисной мембране может быть оценен с помощью флуоресцентной микроскопии, поскольку живые клетки имеют внутриклеточный кальций, а васкуляризацию опухоли можно оценить путем введения флуоресцентного красителя в кровеносные сосуды.
По сравнению с импедансом в солевом растворе ожидается увеличение импеданса in vivo на частотах выше 100 герц из-за присутствия биологической среды. Васкуляризированную нервную паренхиму и опухолевую инфильтрацию можно наблюдать и характеризовать через прозрачный субстрат в течение нескольких недель с помощью двухфотонной микроскопии. Использование трансгенных животных, экспрессирующих флуоресцентные белки в интересующих клетках, может продемонстрировать минимальный воспалительный процесс, индуцированный только имплантацией электродов.
Он может показать наличие микроглии и моноцитов через 26 дней после имплантации импульсным электрическим полем, стимулированным электродом. Вокруг и внутри опухоли были обнаружены как периферические моноциты, так и резонансные клетки микроглии головного мозга. Критическим моментом для успеха в процедуре имплантации является обеспечение герметизации и плоскостности черепного окна, а также оптимизация качества контакта с зондом.
В дополнение к прижизненной визуализации, что можно было бы рассмотреть в сочетании нашего протокола с другими мерами и методами, такими как отбор проб и измерение анализа крови на цитокины, иммунный статус с помощью проточной цитометрии или даже поведенческий анализ. Эта работа открывает путь к использованию гибких имплантируемых устройств для лечения рака и открывает новые перспективы использования биоэлектронной медицины для лечения этого хронического заболевания.
