Bu protokol, glioblastoma üzerindeki terapötik etkilerini incelemek için esnek elektronikler tarafından darbe elektrik alanlarının verilmesine izin verir. Bunu, tümör mikro ortamını görüntüleme ile in vivo olarak görselleştirerek yapıyoruz. Biyoelektronik, titreşen alanların kanser üzerindeki etkisini incelemek için artan karmaşıklığın birkaç farklı modelini kullanarak bu protokole entegre oluyor.
Bu çalışmada sunulan mikrofabrikasyon teknikleri, hasta kaynaklı ksenogreftler de dahil olmak üzere diğer kanser türlerini tedavi etmenin bir aracı olarak da test edilebilir. Bu, her bir hasta için uyarlanmış hassas tıp fikrine doğru ilerler. Bu problar standart mikrofabrikasyon teknikleriyle yapılır, bu nedenle üretim basittir ve temiz bir odaya sahip herkes bunları yapabilir.
Altın elektrot deseni için, temiz cam slaytları biriktirme odasına yerleştirerek bir parilen biriktirme sistemi ile üç mikrometrelik bir parilen C tabakası biriktirin. Bir alüminyum teknede altı gram parilen C'yi tartın, fırına yerleştirin, makineyi boşaltın ve biriktirmeye makalede açıklanan parametrelerle başlayın. Biriktirme tamamlandığında ve buharlaştırıcı sıcaklığı 40 santigrat derecenin altında olduğunda, soğutucuyu, buharlaştırıcıyı, fırını kapatın.
Makineyi havalandırın ve örnekleri toplayın. Spin, plazma ile muamele edilmiş numuneleri 40 saniye boyunca 1.000 kez G'de negatif bir fotodirençle kaplayın. Fotodirenci, ara sayısallaştırılmış elektrot tasarımına sahip bir maske ile pozlayın.
Ardından, maruz kalmayan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonsuz bir geliştiriciye üç dakika daldırın. 20 nanometrelik bir yapışma tabakası krom ve 300 nanometrelik bir altın tabakasını termal evaporatörle biriktirmek için, evaporatör makinesini havalandırın ve üst yuvarlak plakadaki numuneleri metal vidalarla klipsleyin. Özel potaları sırasıyla krom ve altınla doldurun.
Makineyi kapatın ve boşaltın ve numune tutucunun dönüşünü başlatın. Krom içeren potayı seçin ve biriktirme hızı saniyede 0,2 angstroma ulaşana kadar akımı yavaşça artırın. Deklanşörü açın, 20 nanometre krom birikinceye kadar bekleyin, deklanşörü kapatın ve akımı sıfır miliampere kadar yavaşça azaltın.
Pota içeren altını seçin ve saniyede 0,2 angstrom biriktirme hızına kadar akımı yavaşça artırın. Altını buharlaştırmak için deklanşörü açın, 10 nanometre altın birikinceye kadar bekleyin ve ardından yaklaşık 300 nanometre birikinceye kadar biriktirme oranını saniyede 1,5 angstroma yükseltin. Deklanşörü kapatın ve akımı yavaşça sıfır miliampere indirin.
Numuneleri aseton içeren bir beherin içine batırın. Daha sonra numuneleri izopropanol ile durulayın ve bir hava tabancasıyla kurulayın. 35 saniye boyunca 150 kez G'de dört kat PEDOT: PSS çözeltisini döndürün.
Kurbanlık parilen C tabakasını numuneleri suya batırarak çıkarın. PEDOT:PSS filminde kalan sabunu ve düşük molekül ağırlıklı bileşikleri çıkarmak için numuneleri 30 dakika boyunca deiyonize suya batırın ve numuneleri cam substrattan ayırın. 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 75 mikrolitre erimiş% 1 agaroz çözeltisini dikkatlice ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin.
Kararlı hücre hattı üretimi sırasında elde edilen dönüştürülmüş glioblastoma hücrelerini ayırın. Kuyu başına 10.000 glioblastoma hücresi ekleyin ve litre başına bir gram glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat,% 10 fetal sığır serumu, mikrolitre penisilin başına 100 birim ve mikrolitre streptomisin başına 100 mikrogram içeren DMEM kullanarak toplam hacmi kuyu başına 150 mikrolitreye kadar yapın. Agarozun veya sferoidin kendisinin zarar görmesini önlemek için pipet ucunu kuyunun üst kısmında tutarken daha fazla deneye kadar ortamın yarısını her iki günde bir taze ortamla değiştirin.
Japon bıldırcın Coturnix japonica'nın döllenmiş yumurtalarını, her iki saatte bir yumurta döndüren otomatik bir rotatöre sahip tepsilerdeki bir inkübatöre yerleştirin. Bu gün embriyonik gün sıfır olarak kabul edilir. Embriyonik üçüncü günde,% 70 etanol ile önceden yıkanmış ince uçlu bir cımbız kullanarak yumurtaları yavaşça açın.
Embriyoyu plastik bir tartım teknesine dökün, başka bir tartım teknesiyle örtün ve üç gün boyunca 37 santigrat derecede standart nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Embriyonik altıncı günde, 23 gauge iğne ile koryoallantoik membranda küçük bir kesi yapın. Bir pipet kullanarak insizyon üzerine yedi günlük bir sferoid yerleştirin ve embriyoyu başka deneylere kadar üç gün boyunca inkübatöre geri döndürün.
Kraniotomi örtmek için bir damla DPBS yerleştirin. Esnek elektrodu DPBS damlasının üzerine yerleştirin ve probun arkasını temas pedleriyle birlikte yavaşça farenin sırtına yerleştirin. DPBS damlasını, prob dura üzerinde düz durana kadar küçük bir kağıt parçasıyla emin ve beynin eğriliğini takip edin, böylece küçük salin tabakasının tutkal dökülmesine karşı bir bariyer görevi görmesi için elektrotların altında kalmasını sağlayın.
Probun üzerine küçük bir damla silikon yapıştırıcı yerleştirin ve beş milimetrelik yuvarlak bir kapak camı ile örtün. Silikon eşit olarak dağıtılana ve kapak camı ile prob arasındaki mesafe minimum olana kadar kapak camını aşağı doğru itin. Ardından silikonun katılaşması için 30 saniye bekleyin.
Kapak camını sabitlemek için, yanlarına hızlı bir şekilde süper yapıştırıcı uygulayın ve yapıştırıcı katılaşana kadar aşağı doğru itin. Probun boynuna, sabit destek sağlamak için süper yapıştırıcının boynun altına çekilmesine dikkat ederek bir kürdan kullanarak süper yapıştırıcı uygulayın. Kronik bir kapak oluşturmak için kafatasını diş çimentosu ile örtün ve sadece kapak camının kenarlarını örtmek için özel dikkat gösterin.
Probun arkasını kaldırın ve probun boynunun altına çimento uygulayın. Probun geri kalanı, kürlenmeden önce çimento üzerine. Yüzeyini deney sırasında mikroskop hedefinin yolunda değil, kapak camı ile aynı seviyeye yerleştirmek için probun boynunu yavaşça aşağı doğru itin.
Prob üzerinde sağlam bir tutuş elde etmek için prob boynunun üst kısmını 1,5 milimetreden fazla olmayan diş çimento tabakası ile örtün. İki foton görüntüleme için daldırma sıvısı için bir havza oluşturmak üzere kapak camının etrafında bir ila iki milimetrede 1,5 milimetrelik bir sırt sunan bir çimento kuyusu inşa edin. Çimento sertleştikten sonra, ameliyat sonrası analjezi uygulayın ve hayvanı bir kağıt havluya sararak ve kızılötesi bir ampulün yakınına yerleştirerek iyileşene kadar sıcak tutun.
PEDOT: PSS kaplı elektrotlar, bir kesme frekansı ile ayrılmış tipik kapasitif ve dirençli baskın bölgeleri gösterirken, kaplanmamış elektrotlar sadece kapasitif davranış gösterir. Parlak alan mikroskobu ile gözlemlenen sferoidlerin büyümesi, hücre hattına ve tohumlanan hücre sayısına bağlı olarak küresel ve yoğun sferoidler elde etmek için en az iki veya üç güne ihtiyaç duyulduğunu ortaya koymuştur. In ovo modelinde, koryoallantoik membrandaki sferoidlerin grefti floresan mikroskobu ile değerlendirilebilir, çünkü canlı hücreler hücre içi kalsiyuma sahiptir ve tümörün vaskülarizasyonu kan damarlarına floresan boya enjekte edilerek değerlendirilebilir.
Tuzlu su çözeltisindeki empedansla karşılaştırıldığında, biyolojik bir ortamın varlığı nedeniyle 100 hertz'in üzerindeki frekanslarda empedansın in vivo olarak artması beklenir. Vaskülarize nöral parankim ve tümör infiltrasyonu iki foton mikroskobu ile haftalar boyunca şeffaf substrat yoluyla gözlemlenebilir ve karakterize edilebilir. İlgilenilen hücrelerde floresan proteinleri eksprese eden transgenik hayvanların kullanımı, tek başına elektrot implantasyonu ile indüklenen minimal enflamatuar süreci gösterebilir.
İmplantasyondan 26 gün sonra mikroglia ve monositlerin varlığını gösterebilir, darbeli elektrik alanları uyarılmış elektrot. Hem periferik monosit türevi hem de beyin rezonans mikroglial hücreleri tümörün etrafında ve içinde bulundu. İmplant prosedüründe başarı için kritik nokta, kraniyal pencerenin sızdırmazlığını ve düzlüğünü sağlamak ve prob ile temasın kalitesini optimize etmektir.
İntravital görüntülemeye ek olarak, protokolümüzü sitokinler için kan çalışmasının örneklemeleri ve ölçümleri, akış sitometrisi ile bağışıklık durumu ve hatta davranışsal analiz gibi diğer önlemler ve tekniklerle birleştirmeyi düşünebilecek şeyler. Bu çalışma, kanser için esnek implante edilebilir cihazların kullanımının önünü açmakta ve bu kronik hastalık için biyoelektronik tıbbın kullanımı için yeni umutlar açmaktadır.
