الزرد فريد من نوعه في قدرته الجوهرية على تجديد العديد من أنواع الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك RPE. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد المسارات الجزيئية التي تدفع تجديد RPE والآليات المتعلقة بمرض RPE. التنوع هو ميزة أساسية لهذه المنهجية.
بالإضافة إلى دراسة تجديد RPE ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص العمليات التنكسية RPE وآثار تلف RPE على الأنسجة المجاورة في العين. الثدييات ، بما في ذلك البشر ، غير قادرة على إصلاح إصابات RPE الكبيرة الناتجة عن الصدمات أو الأمراض التنكسية. يعد استخدام أسماك الزرد كأداة لاكتشاف العوامل المؤيدة للتجدد من RPE خطوة مهمة نحو تعزيز تجديد RPE للثدييات.
لتحضير محلول MTZ طازج 10 ملليمولار ، بعد خمسة أيام من الإخصاب ، أضف مسحوق MTZ إلى ماء النظام بدون PTU واخلطه جيدا عن طريق الاهتزاز القوي لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بتبريد محلول MTZ 10 ملليمولار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على دوار الطاولة أو الخلاط. لفحص يرقات الزرد من الجينات المعدلة rpe65a:nsfB-eGFP، افصل يرقات eGFP الإيجابية المعدلة وراثيا عن يرقات eGFP السلبية غير المعدلة وراثيا باستخدام مجهر ستيريو فلورسنت مع ليزر إثارة 488 نانومتر.
استيقظ على الفور من اليرقات التي تم فحصها عن طريق السحب مباشرة إلى طبق بتري مع 1.5X PTU طازج بدون تريكاين. عند الانتهاء من الفحص ، قم بفصل اليرقات الإيجابية eGFP إلى مجموعتين من أطباق Petri ، مجموعة واحدة لتلقي علاج MTZ ومجموعة واحدة لتكون السيطرة غير المنفذة. ثم قم بإزالة ظهارة صبغة الشبكية عن طريق إزالة 1.5X PTU من أطباق العلاج المذبوحة وإضافة محلول MTZ الطازج 10 ملليمولار.
قم أيضا بإزالة 1.5X PTU من أطباق التحكم غير المنفذة وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU. قم بإزالة محلول MTZ 10 مللي مولا بعد 24 ساعة بالضبط وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU. تغيير مياه النظام العذبة دون PTU على الأطباق السلبية MTZ.
فحص يرقات eGFP الإيجابية في أربعة أيام بعد الإخصاب. يظهر eGFP بعد أربعة أيام من الإخصاب ، ولكنه يبدو أكثر قتامة من شدة الإشارة في اليوم الخامس. ضع يرقات eGFP الإيجابية في أطباق من ستة آبار بدلا من أطباق بتري بكثافة لا تزيد عن 10 يرقات لكل بئر للعلاج الدوائي.
قم بتعيين لوحات منفصلة من ستة آبار لليرقات المبطنة وغير المذبوحة. حدد حجم 15 ميكرومولار IWR-1 أو الحجم المطابق للمعالجة المسبقة للتحكم في مركبة DMSO اللازمة و aliquot 1.5X PTU في أنابيب مخروطية وفقا لذلك. أضف مخزون IWR-1 إلى 1.5X PTU للحصول على تركيز نهائي من 15 ميكرومولار IWR-1.
أضف حجما مطابقا من مخزون DMSO إلى 1.5X PTU. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات. قم بإزالة 1.5X PTU من يرقات eGFP الإيجابية في لوحات من ستة آبار وأضف خمسة ملليلترات لكل بئر من 0.06٪ DMSO الطازج أو 15 معالجة IWR-1 ميكرومولار.
قم بإلغاء RPE في اليوم التالي. في خمسة أيام بعد الإخصاب ، حدد حجم العلاجات الدوائية وعلاجات التحكم في المركبات اللازمة لكل من الصفائح المكونة من ستة آبار غير مأخوذة و aliquot كميات مناسبة من مياه النظام العذبة بدون PTU أو محلول MTZ 10 ملليمولار في أنابيب مخروطية. أضف حلول مخزون IWR-1 و DMSO إلى الأنابيب المخروطية ذات الصلة كما تم تنفيذها سابقا.
تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات. قم بإزالة 0.06٪ DMSO و 15 ميكرومولار IWR-1 من المعالجات المسبقة في 1.5X PTU من لوحات ستة آبار محددة غير ممسوخة ومحذوفة. قم بالتجديد بمياه النظام العذبة المناسبة دون معالجة محلول PTU و MTZ.
قم بإزالة 0.06٪ DMSO و 15 معالجة IWR-1 ميكرومولار في محلول MTZ 10 ملليمولار بعد 24 ساعة بالضبط وتجديدها بالعلاجات في مياه النظام العذبة بدون PTU. قم بتجديد 0.06٪ DMSO و 15 معالجة IWR-1 ميكرومولار في مياه النظام العذبة بدون PTU على لوحة الآبار الستة غير المنفذة. رصد نجاح ومدى الاستئصال في الجسم الحي باستخدام الإضاءة الضوئية المنقولة على مجهر ستيريو للحفاظ على اليرقات بعد الاستئصال الوراثي.
لإنشاء منطقة اهتمام RPE أو عائد الاستثمار باستخدام فيجي ، افتح صورة TIFF ثمانية بت ، وأعد توجيه الصورة بحيث يكون الجانب الظهري لأعلى ويتم ترك الجانب البعيد عن طريق اختيار الصورة وتحويلها وقلبها أفقيا. بالنسبة للأمر الأخير، حدد الخيار الذي يناسب الاتجاه المطلوب لتلك الصورة. ابدأ تشغيل مدير عائد الاستثمار عن طريق اختيار التحليل والأدوات ومدير عائد الاستثمار.
استخدم الصورة والتكبير/التصغير والتبديل بين قناتي DAPI وBrightfield. استخدم اختصارات لوحة المفاتيح لتحقيق الكفاءة. حدد النقطة التي يكون فيها الجانب القمي من RPE مجاورا من طرف الغشاء الخارجي المحدد واستخدم هذا المعلم التشريحي كنقطة انطلاق عائد الاستثمار.
قم بإنشاء عائد استثمار RPE باستخدام أداة تحديدات المضلع في شريط أدوات فيجي باستخدام كل من قنوات الصور DAPI و Brightfield ووظيفة تكبير الصورة لتحديد حدود RPE القمية والقاعدية. اجعل الأطراف الظهرية والبطنية لعائد الاستثمار إلى نقطة حادة بدلا من التثبيط أو التقريب. أضف عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار.
احفظ ملف عائد الاستثمار عن طريق اختيار المزيد واحفظ داخل مدير عائد الاستثمار. انقر نقرا مزدوجا فوق rpegen. m لفتحه في جزء المحرر.
ضمن قسم المتغير المعرف من قبل المستخدم من rpegen. m file ، أدخل مواقع الدليل للمجلدات التي تحتوي على ملفات عائد الاستثمار وملفات صور TIFF وحيث يجب حفظ ملفات الإخراج. أدخل اسم المجموعة لملف الحصيرة المراد تصديره وموقع قناة Brightfield في مكدس صور TIFF.
قم بتشغيل البرنامج النصي بالنقر فوق الزر "تشغيل" في قائمة المحرر أعلى MATLAB. بعد حفظ ملف MAT ، سيظهر شكل ثلاث لوحات وسيتم حفظه أيضا كملف PDF في دليل الإخراج لكل تشغيل صورة. انتظر حتى يتم حفظ ملفات PDF لمراقبة الجودة هذه في مجلد المخرجات ويختفي الشكل الأخير.
افتح ملفات PDF الفردية وتحقق من تطابق جميع عائد الاستثمار مع صور Brightfield. انقر نقرا مزدوجا فوق rpegen_permplot. m ملف لفتحه في علامة تبويب محرر جديد.
ضمن قسم المتغيرات المعرفة من قبل مستخدم واحد، أدخل موقع الدليل لمجلد الإخراج الذي يحتوي على ملفات MAT من تشغيل rpegen. م النص. أدخل كل اسم ملف MAT ليتم تحميله.
قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق زر تشغيل القسم في قائمة المحرر. في القسم الثاني، أدخل أسماء المجموعتين لإجراء مقارنة إحصائية في متغيري البيانات A والبيانات B وحدد عدد تكرارات محاكاة التباديل في متغير الممثلين. تم استخدام 2000 مندوب فقط لهذا العرض التوضيحي لتقليل وقت المعالجة.
قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق زر تشغيل القسم في قائمة المحرر. قم بتشغيل شكل الخريطة الحرارية ونتائج المجموعة وأقسام القيمة P بشكل مستقل باستخدام زر قسم التشغيل. أظهر الضرر الكامل لليرقة بعد الإخصاب لمدة خمسة أيام تعبيرا جينيا مشرقا في RPE في وقت فحص الاستئصال الجيني.
أظهر التشريح المبرد المستعرض لليرقة بعد الإخصاب لمدة ستة أيام أن التعبير الجيني المتحول يقتصر على خلايا RPE الناضجة مع ألمع تعبير يقتصر على 2/3 المركزي من RPE. تشير رؤوس الأسهم إلى الزغابات الدقيقة القمي. كشف التشريح المبرد المستعرض ليرقة ما بعد الإصابة لمدة يوم واحد عن اضطراب في مورفولوجيا الخلايا الإيجابية eGFP.
تشير الأسهم إلى النوى البيكنوية. أظهرت أضرار التركيب الكاملة ليرقات ما بعد الإخصاب لمدة سبعة أيام غير متوقفة تصبغ RPE في جميع أنحاء العين وأظهرت يرقات ما بعد الإصابة لمدة يومين منطقة استئصال غائبة عن الصباغ في RPE المركزية. أظهرت مؤامرة تم إنشاؤها باستخدام RpEGEN تشابها بين مجموعات DMSO و IWR-1 التي استمرت تسعة أيام بعد الإخصاب عبر طول RPE.
أظهرت المؤامرة كثافة بكسل أخف بشكل عام في مجموعات DMSO و IWR-1 التي تم إزالتها لمدة أربعة أيام بعد الإصابة ، والتي بدت أخف وزنا في IWR-1 المذبوحة عند مقارنتها بأي مجموعة علاج أخرى. كانت الاختلافات في تصبغ RPE المركزي كبيرة عند مقارنة اليرقات المعالجة IWR-1 المذبوحة بالضوابط المعالجة DMSO المذبوحة. باستخدام نموذج استئصال الزرد هذا ، تمكنا من تحديد العديد من مسارات الإشارات الجزيئية ، مثل إشارات الرياح التي أظهرناها هنا ، والتي تعد منظمات مهمة لتجديد RPE.
