فإن الكتاب أود أن أشكر الحياة Freimann مركز العلوم ومركز البحوث للموظفين اسماك الزرد لرعايتهم والحفاظ على الزرد.

1. Morpholino التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي لجميع oligos morpholino يكون مصمما خصيصا وأمرت خلال GeneTools (Philomath ، OR). نستخدم المشحون إيجابيا lissamine الموسومة morpholinos لدفع morpholinos electroporated نحو القطب السالب. حاولنا ، دون جدوى ، لاستهداف المشحونة سلبا فلوريسئين الموسومة morpholinos إلى القطب الموجب باستخدام هذه التقنية. تمييع nmol 300 إلى 100 من morpholino ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لانتاج حل 3 مم. قسامة في morpholino إلى عدة أنابيب microcentrifuge البارافين مختومة. تخزين بعيدا عن الضوء في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز morpholino بواسطة تمييع 5 ميكرولتر من morpholino (أو المياه المستخدمة لتخفيف morpholino باعتبارها فارغة) في 95 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك N 0.1. ضبط معمل الطول الموجي (λ) إلى 265 نانومتر. حساب ثابت لmorpholino باستخدام المعادلة التالية : ثابت = الوزن الجزيئي خاص لmorpholin الخاصس X 1000/molar الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تجد الوزن الجزيئي والبيانات الامتصاصية المولي على ورقة &quot;أليغو خصائص&quot; المتوفرة مع كل morpholino. تحليل فارغة للتحقق من القراءات قراءات أساسية واتخاذ كل morpholino المخفف. مضاعفة الامتصاصية في 265 نانومتر كل morpholino التي تحدد ثابتها وعامل إضعاف للحصول على التركيز في ميكروليتر / نغ. تقسيم هذا العدد من الوزن الجزيئي لتحديد التركيز في مم. تمييع morpholino ، إذا لزم الأمر ، إلى تركيز العمل. </li></ol> 2. إزالة الطبقة القرنية الخارجي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 12/06 الزرد البالغين من العمر في الشهر Tricaine أو 2 ملغ في phenoxyethanol - 1.0 / مل في مياه الصهاريج الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبلل التفاف الزرد في قطعة من منشفة ورقية ، يغطي الخياشيم ، ولكن ترك العين تتعرض لها. يوضع السمك ملفوفة تحت المجسام ويتم زيادة التكبير حتى قطره من العين يملأ ما يقرب من ثلثالمجال البصري (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام دومون # 5 ملاقط ، والاستيلاء على القرنية الخارجي بالقرب من الشق البصري. وهذا النسيج الملون باللون الأحمر ، والمسمى &quot;OC&quot; في الشكل 1. هناك نتوء بسيط أو الشفة المشار إليها بواسطة السهم المسمى &quot;CL&quot;. سحب بزاوية منخفضة (أي 10 درجة) في جميع أنحاء العين لإزالة القرنية الخارجي. مع الممارسة ، ويمكن الانتهاء من هذا في اقتراح واحد. إذا كانت زلة ملاقط ، وإعادة الاستيلاء على الأنسجة وسحب مرة أخرى في زاوية منخفضة حتى إزالتها. ويمكن للقرنية جيدا المرفقة يؤدي إلى طرد العين من مأخذ عندما انسحبت. يمكنك إبقاء العين من أن تصبح طردتهم مستقرا مع مجموعة أخرى من ملاقط. </li></ol> 3. شق القرنية والحقن morpholino : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد إزالة القرنية الخارجي ، وجعل شق صغير في القرنية حيث يلتقي التلميذ القزحية (الشكل 2). يتم ذلك باستخدام شفرة مشرط الياقوت (انظر المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 0.5 ميكروليتر من محلول 3.0 ملي morpholino الى Hamiltعلى حقنة مجهزة قياس 33 القابلة للإزالة ، كليلة نهاية الإبرة (انظر المواد). ماصة صعودا وهبوطا لإزالة فقاعات الهواء في السطر. إدراج بعناية الإبرة في الجسم الزجاجي من خلال شق (الشكل 2). لا يدخل الإبرة بعيدا أو سوف ثقب في الشبكية أو تهجير العدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ببطء الحل morpholino في الفضاء الزجاجية. اعتمادا على عمر السمكة ، فإن المساحة الزجاجية عقد ~ 0.5 ميكرولتر. يجب عليك تصور الزجاجي بغير لون تتسرب من شق كما هو النازحين من قبل حل morpholino. حتى حقن كمية صغيرة من التسريبات morpholino حل للخروج من شق. يجب أن تصور بوضوح morpholino lissamine الموسومة داخل العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، وعودة الأسماك إلى خزان للتعافي. نحن عادة حقن العين اليسرى فقط ، وذلك باستخدام العين اليمنى كعنصر تحكم uninjected ، ولكن في كلتا العينين electroporation هو ممكن. </li></ol> 4. Electroporation : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التاليضخ ما يقرب من 10 الأسماك ، وإعادة حقن تخدير سمكة والتفاف عليه في قطعة مبللة من منشفة ورقية ، وتغطي فقط الخياشيم ، ولكن ترك العين تتعرض لها. نقل السمك إلى طبق بتري. وضعت على قفازات اللاتكس أو مشابهة لتجنب التعرض للتخدير. أثناء الضغط بلطف الأسماك إلى قاع الطبق ، وملء الطبق مع تخدير (الشكل 3 ، لوحة على اليسار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفيحة البلاتين 3 ملم وقطره الكهربائي (راجع المواد) يموضع النبضات electroporation إلى نصف ما يقرب من شبكية العين. نحن الهدف عادة في الشبكية الظهرية. اضغط بلطف القطب الموجب النزولي في النصف بطني من العين. مع إزالة القرنية الخارجي ، واستدارة العين بسهولة ، ويعرض الجزء الظهري من مقلة العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين لا يزال الضغط باستمرار على الجانب البطني من العين ، ومكان بالقرب من القطب السالب (~ 1-2 ملم) في النصف يتعرض الظهرية من العين. يجب الحرص على عدم لمس القطب السالب مباشرة للعين ، والتي سوف تؤدي إلى الإضرارشبكية العين الظهرية. بمجرد تحديد المسافة المناسبة بين الأقطاب ، واستخدام المسمار التعديل على مقبض الأقطاب للحفاظ على ذلك عندما انتشر electroporating. هذا يحافظ على القطب السالب على مسافة المثلى من مقلة العين عند الضغط على أسفل القطب الموجب في الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate العين باستخدام الموجات ساحة CUY21 Electroporator (انظر المواد). يجب تعيين المعلمات electroporation لاثنين من البقول 50 مللي ثانية على التوالي ، في 75 وقفة مع V - 1 ثانية بين البقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الأسماك إلى الخزان. نبدأ عادة بروتوكول لدينا الضوء الناجم عن تنكس الشبكية ثابت فور electroporation. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة 3-5 أيام بعد electroporation (اعتمادا على استقرار morpholino) ، ويمكن تسمية lissamine يمكن تصور في جميع طبقات الشبكية في الشبكية مقطوع (الشكل 4). هذا بمثابة تأكيد لوجودوصفت morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكننا تحقيق كامل ضربة قاضية البروتين تصل إلى 3-5 أيام التالية electroporation ، تبعا للكفاءة morpholino (الشكل 5). عادة ، خلال دراسات علاج الضوء ، ونحن في موسم الحصاد العينين 3 أو 4 أيام بعد electroporation morpholino. يتم ذلك عن طريق إزالة العين بالكامل مع ملقط دومون 5B # مع نهايات منحنية الشكل (6 ؛ المواد) ، ومعالجة الأنسجة لالمناعية 15. كما هو الحال مع أي أسلوب ضربة قاضية ، يجب أن تظهر مظاهرة من ضربة قاضية كفاءة من أجل التحقق من النمط الظاهري. لذا ، نقترح الحصول على أمصال مضادة لبروتين اهتمامك. بدلا من ذلك ، وإذا كان الضد غير متوفر ويتم توجيه morpholino إما إلى متقبل لصق أو المانحة في موقع مرنا مسبقا ، فإنه سيتم منع الربط الفعال للمرنا. في هذه الحالة ، فمن الممكن استخدام عكس المنتسخة - PCR لتضخيم تسلسل الحمض النووي الريبي المرافقة في morphant وتحديد كفاءة عرقلة splic العاديجي النمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما شبكية العين والأنف لمقطوع من الزمانية على المحور الظهري البطني ، مربعات مظللة الزرقاء (الشكل 6) تمثل مناطق الشبكية التي غالبا ما تلف من الحدث نفسه electroporation. المربع المظلل الوردي يمثل المنطقة التي تستهدف إدخال morpholino إلى خلايا الشبكية التي electroporation. </li></ol><img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي يصور إزالة طبقات الطلائية للقرنية. اللوحة اليسرى ويبين الملامح الرئيسية الهيكلية للعين ، بما في ذلك العدسة (L) ، والزجاجي (فيت) ، وشبكية العين (R) ، والقرنية الخارجي (OC) ، والقرنية الداخلية (IC) ، وبروز القرنية ( CL). ويظهر اتجاه العين في الطبقة السفلى من حق الفريق الأول ، والمسمى الأمامي (A) ، الخلفي (P) ، الظهرية (D) ، والبطني (V). تلوين أحمر يدل على القرنية الخارجي التي يتم إزالتها. عموم second<html> شرم يوضح كيف يتم استخدام ملقط لفهم بروز القرنية واخراج القرنية الخارجي عبر العين في زاوية منخفضة (الفريق الثالث). لوحة الحق يبين كيف يمكن استخدام ملقط من الزوج الثاني للعين ثابت في حين سحب القرنية. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> الشكل 2. تخطيطي للخطوات المشاركة في الحقن intravitreal من morpholino. يتم إجراء شق صغير في العين حيث يلتقي التلميذ القزحية (اللوحة اليسرى). وينبغي أن الفجوة الناتجة تكون كبيرة بما يكفي لإبرة قياس 33 ، وهي مليئة morpholino الحل ، على أن تضاف (وسط لوحة). حقن ببطء 0.5 ميكروليتر من المحلول في الزجاجي (اللوحة اليمنى). يجب عليك تصور كمية صغيرة من محلول الزجاجية يخرج من شق كما يتم استبدال جزء من الجسم الزجاجي من قبل مع lissamine الموسومة morpholino (اللوحة اليمنى). ig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. تخطيطي لإجراء electroporation العامة. يتم التفاف بلطف تخدير الأسماك ، والتي تم حقن intravitreally مع morpholino في منشفة ورقية رطبة (اللوحة اليسرى). يجب على منشفة ورقية تغطية الخياشيم ، ولكن ليس عرقلة العين (وسط لوحة). اضغط بلطف القطب الموجب لأسفل على بطني جزء من العين ، والسماح النصف الظهرية من العين لتدوير للخروج من مأخذ. وضع القطب السالب حوالي 1 ملم من النصف الظهرية من العين وبدء electroporation (اللوحة اليمنى). <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> الشكل 4. متحد البؤر صورة مقارنة في شبكية العين عن طريق الحقن دون electroporated intravitreally a morpholino lissamine الموسومة (A) ، والشبكية a حقن intravitreally وelectroporated مع morpholino lissamine الموسومة (B). تم العثور على تسمية lissamine في جميع الطبقات الشبكية وأنواع الخلايا. ROS ، قضيب الخارجيشرائح ؛ y. قل ، طبقة النووي الخارجي ؛ ، طبقة داخلية INL النووية ؛ GCL ، طبقة الخلايا العقدية. <img alt="الشكل 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> الشكل 5. الصور متحد البؤر مقارنة PCNA immunolocalization في شبكية العين electroporated مع morpholino التحكم (لوحات اليسار) وشبكية العين مع electroporated morpholino مكافحة PCNA (لوحات اليمين) قبل الضوء الناجم عن موت الخلايا المستقبلة للضوء. وضعت مظلمة مكيفة الزرد البيضاء الكبار في ضوء مكثفة مستمرة لمدة 1 أو 2 أو 3 أيام بعد electroporation من morpholino. فشلت في السيطرة morpholino لقمع التعبير PCNA زيادة في شبكية العين بأضرار خفيفة. وmorpholino مكافحة PCNA طرقت بكفاءة أسفل PCNA بروتين تعبير من خلال ثلاثة أيام من وقوع اضرار طفيفة ثابت مكثفة. <img alt="الشكل 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> الشكل 6. التخطيطي (اللوحة اليسرى) تظهر قلع العين لعوrocessing cryosectioning ، والتي تتم على طول محور بطني الظهرية. المربع الوردي مظللة (اللوحة اليمنى) يظهر في المنطقة الشبكية مع أكبر قدر من ضربة قاضية البروتين باستخدام هذه التقنية. المربعات الزرقاء المظللة تمثل المناطق التي غالبا ما تكون تضررت من جراء الحدث electroporation. يسمى اتجاه العين الأمامي (A) ، الخلفي (P) ، الظهرية (D) ، والبطني (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

ليس لدينا ما تكشف

مؤخرا ، بحثت تحليلين ميكروأري التغييرات التعبير الجيني التي حدثت خلال تجديد إما شبكية العين للضوء تلف أو تصحيحا جراحيا ، يستأصل الشبكية 10 و 16. وكشفت دراسات كلا الجينات العديدة التي عرضت تغييرات كبيرة في التعبير ، وإما زيادة أو النقصان ، يرجح أن تكون مطلوبة من أجل الأحداث المختلفة التي تحدث أثناء تجديد شبكية العين ، مثل رجوعها من الدبقية مولر في دورة الخلية ، واصلت الانتشار وهجرة أسلاف الخلايا العصبية في طبقة الشبكية التالفة ، والتفريق بين الأسلاف العصبية إلى نوع من الخلايا العصبية الصحيحة. في حين أن المقارنة المباشرة لهاتين المجموعتين البيانات ميكروأري تكشف الجينات المرشحة التي قد تكون ضالعة في هذه الأحداث الخلوية ، في نهاية المطاف يجب أن يكون اختبار هذه الجينات والبروتينات التي ترميز لتحديد ما إذا كانت ضرورية لتجديد الخلايا العصبية. هنا ، نحن تصف خسارة قوية من وظيفة إلى نهج conditioالبروتينات ضربة قاضية نالي الفائدة في شبكية العين الزرد الكبار. وقد استخدمت هذه التقنية لدراسة كل من البروتينات داخل الخلايا وخارج الخلية ، وكذلك جزيئات الإشارة ، عوامل النسخ والبروتينات اللازمة لتكرار الحمض النووي 17-19. وهكذا ، ساعد هذا الأسلوب إلى حد كبير فهمنا للآلية الجزيئية الكامنة وراء الشبكية التجدد الكبار في الزرد. نحن اختبار المعلمات electroporation متعددة (الجهد ، وعدد من البقول ، والوقت بين البقول) قبل التوصل إلى بروتوكول ناجحة. يستخدم التقرير السابق للelectroporating morpholinos في الزعنفة الذيلية الزرد تجديد 10 نبضات في الجهد المنخفض (15 V) 20. لأن حاصرت الشبكية الزرد الكبار بحلول طبقات خلايا متعددة وغير قابل للوصول بسهولة إلى أقطاب منتاش ، كانت المعايير المستخدمة في زعنفة ناجحة في electroporating بكفاءة morpholinos الكبار في شبكية العين. في المقابل ، فان الجهد العالي (100 V) الدقة في كثير من الأحيانulted في الموت للأسماك. مؤخرا ، 5 البقول من 80 وصفت الخامس لelectroporate DNA البلازميد في شبكية العين الماوس الجرو الوليد 21. وجدنا أن أقل قليلا مكثفة 2 البقول من 75 V أسفرت electroporation الناجح لmorpholinos في شبكية العين الزرد الكبار مع بقاء 100 ٪ من الأسماك المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أن إزالة معظم الخارجي (أو الخارجي الأكثر) المكون من القرنية إلى زيادة كبيرة في كفاءة electroporation. وقد تزايد عدد نبضات قضاء على الحاجة لإزالة هذا النسيج لكنها قد تتسبب أيضا في زيادة تلف الأنسجة. دراسات مراقبة واسعة النطاق أثبتت أن هذه المعايير لم يسبب أي موت الخلايا الشبكية كبيرة أو تغيير استجابات محددة الخلوية التي لوحظت خلال 19 التجدد مبصرة. مكسب من بين الدراسات وظيفة لا يمكن حاليا استخدام هذه التقنية في الجسم الحي ، وذلك بسبب عدم قدرتنا على الدوام electroporate الأحماض النووي الريبي كبيرة في جميع صetinal الخلايا. ومع ذلك ، فإن نجاح electroporating البلازميدات في شبكية العين الماوس في الجسم الحي والزرد في شبكية العين explants يوحي بأنه لا يزال هناك احتمال في الزرد 21 و 22. واحدة من نقاط القوة في هذه التقنية هو electroporation يبدو أن أعرض morpholino بكفاءة في جميع أنواع الخلايا الشبكية المختلفة. ومع ذلك ، كان واحدا الضعف المحتملة التي electroporation تسليمها بكفاءة morpholino في المناطق الوحيدة التي الشبكية الظهرية والمركزية. حدث electroporation الثانية في اتجاه النصف البطنية من شبكية العين في استهداف النتائج الجيدة لجميع الطبقات ، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الضرر. هذا التقييد المكاني ربما كان ذلك بسبب الشكل والموضع من الأقطاب الكهربائية. قد استخدام أقطاب كوب مصمم خصيصا على شكل يمكن أن توضع حول العين في تحسين هذا الضعف. هذا التقييد المكاني للتسليم morpholino يحد من استخدام هذه التقنية ، ويحول دون استخدام للمقايسة يمثح وتحليل ERG التي تتطلب إجراء تقييم عالمي للشبكية. وتجدر الإشارة إلى أنه كما هو الحال مع أي تجربة morpholino ، فإنه من المستحسن لتأكيد النتائج الخاص به ثانية ، وعدم التداخل morpholino مرنا إلى الهدف. في بعض الحالات ، فمن الممكن أيضا اثنين من electroporate morpholinos مختلفة في نفس الوقت ضربة قاضية إلى التعبير عن اثنين من البروتينات المختلفة. أثبتنا ذلك من خلال اسقاط التعبير عن Pax6a على حد سواء والبروتينات Pax6b ، منفردة ومجتمعة 18. على الرغم من أننا أظهر استخدام هذه التقنية مع نموذجنا الأضرار الخفيفة يمكن ، من المحتمل أن تستخدم لدراسة تجديد في النماذج أو غيرها من الأضرار 2-8 تستخدم لفحص وظيفة من البروتينات الموجودة في الشبكية التالفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تستخدم من electroporation morpholinos ضربة قاضية إلى التعبير عن قنوات محددة أو الجزيئات نقل الإشارة في العقدة أو خلايا عديم الاستطالات ودراسة ثم وظيفة هذه الإشاراتمسارات في معالجة بصرية. لكن ، وكما morpholinos تؤثر فقط على الترجمة من البروتين الجديد ، فإن المرء لابد أن ينتظر حتى الذاتية دوران البروتين يحدث قبل أن يتم تنفيذ الفحص. اعتمادا على الاستقرار من البروتين ، يمكن أن تتراوح من ساعة إلى 18 يوما.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> CUY21 - EDIT أو CUY21 - SC ساحة موجة electroporator </td><td> بروتك الدولية </td><td> CUY21EDIT أو CUY21SC </td><td> كلا وحدات العمل لهذا البروتوكول </td></tr><tr><td> 3 ملم أقطاب قطرها مجداف </td><td> بروتك الدولية </td><td> CUY 650 - P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools ، ذ م م </td><td></td><td> وينبغي Morpholino مصممة خصيصا لبروتين اهتمامك </td></tr><tr><td> 2 - Phenoxyethanol </td><td> سيغما </td><td> 77861 - 1L </td><td> التخدير ؛ تمييع 1:1000 في الماء الأسماك للنظام الداخلي ، 1:500 للقتل الرحيم </td></tr><tr><td> دومون # 5 ملاقط </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td>14095 </td><td> أي ملاقط # 5 مع العمل </td></tr><tr><td> ملاقط دومون 5B # مع نصائح الزاوية </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> 500234 </td><td> تستخدم في العين استأصل القتل الرحيم التالية </td></tr><tr><td> الياقوت شفرة ، وضعف حافة انس ، 1 ملم واسعة ، مع مقبض السكين الياقوت </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> شفرة : 500314 مقبض : 500317 </td><td></td></tr><tr><td> هاميلتون المحاقن مع إزالة 33 قياس حادة في نهاية الإبرة </td><td> هاميلتون الشركة </td><td> حقنة : 87930 إبرة : 7762-06 </td><td> إزالة الإبرة التي تأتي مع حقنة واستبدالها ب 33 عيار حادة في نهاية الإبرة </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

العديد من الأمراض المدمرة الموروثة العين ينتج العمى التدريجي الذي لا رجعة فيه لأن البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المريضة أو الموت في شبكية العين. في المقابل ، فإن الشبكية الزرد أخلاقي قوي يمتلك القدرة على التجدد تلقائيا أي فئة العصبية التي فقدت في مجموعة متنوعة من نماذج مختلفة لتلف شبكية العين ، بما في ذلك ثقب في شبكية العين ، التذرية الكيميائية ، وارتفاع في درجة الحرارة المركزة ، والعلاج المكثف ضوء 1-8. مختبرنا تميزت على نطاق واسع من التجديد المستمر مبصرات التالية العلاج المكثف ضوء في شبكية العين والخلايا العصبية الداخلية بعد intravitreal ouabain حقن 2 ، 5 ، 9. في جميع الحالات ، المقيم الدبقية مولر إعادة إدخال دورة الخلية لانتاج الخلايا العصبية الأسلاف ، التي ما زالت تتكاثر وتهاجر إلى طبقة الشبكية سليمة ، حيث تفرق في الخلايا العصبية ناقصة. تتميز نحن خمس مراحل مختلفة خلال تجديد داما الخفيفGED الشبكية التي أبرزها استجابات الخلايا المحددة. حددنا عدة جينات وأعرب تفاضلي في كل مرحلة من التجدد في شبكية العين عن طريق التحليل ميكروأري مرنا 10. كثير من هذه الجينات هي أيضا حاسمة بالنسبة للتنمية العين. لاختبار دور كل الجينات مرشح / البروتين خلال تجديد شبكية العين ، نحن في حاجة إلى تطوير طريقة للحد من التعبير مشروط من البروتين المرشح الوحيد في بعض الأحيان خلال التجديد للشبكية الكبار. وتستخدم على نطاق واسع لدراسة oligos Morpholino فقدان وظائف بروتينات معينة أثناء وضع الزرد ، القيطم والحمص ، والماوس ، والاورام في 11-14 xenografts الإنسان. هذه basepair oligos تعديل تسلسل الحمض النووي الريبي مع مكملة لكتلة إما الربط أو الترجمة من الحمض النووي الريبي الهدف. Morpholinos مستقرة في الخلية ، ويمكن القضاء عليها أو التعبير &quot;ضربة قاضية&quot; البروتين لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام 12. هنا ،وصفنا أسلوبا لاستهداف التعبير بكفاءة ضربة قاضية البروتين في شبكية العين الزرد الكبار. هذا الأسلوب يستخدم lissamine الموسومة morpholinos العقاقير التي يتم حقنها في الجسم الزجاجي للعين الزرد الكبار. باستخدام الملقط الكهربائي ، ثم هو electroporated morpholino في جميع أنواع الخلايا في شبكية العين الظهرية والمركزية. Lissamine يوفر هذا الاتهام على لmorpholino electroporation ويمكن تصور لتقييم وجود morpholino في خلايا الشبكية. يمكن أن تستخدم ضربة قاضية الشرطية في شبكية العين لدراسة دور بروتينات معينة في أوقات مختلفة خلال التجدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة دور بروتينات معينة في الشبكية سليمة ، في عمليات مثل تنبيغ البصرية وتجهيز الخلايا العصبية البصرية في الدرجة الثانية.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

تم وصف طريقة لضربة قاضية مشروط التعبير بروتين هدف في شبكية العين الزرد الكبار ، والذي ينطوي على حقن العقاقير وintravitreally morpholinos electroporating لهم في شبكية العين. طرقت هو البروتين الناتج باستمرار لعدة أيام ، والذي يسمح اختبار دور البروتين في تجديد أو شبكية العين سليمة.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

in-vivo-electroporation-of-morpholinos-into-the-adult-zebrafish-retina

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.0K Views.  Wayne State University School of Medicine. تم وصف طريقة لضربة قاضية مشروط التعبير بروتين هدف في شبكية العين الزرد الكبار ، والذي ينطوي على حقن العقاقير وintravitreally morpholinos electroporating لهم في شبكية العين. طرقت هو البروتين الناتج باستمرار لعدة أيام ، والذي يسمح اختبار دور البروتين في تجديد أو شبكية العين سليمة.

Video: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

عضوي النمط من الثقافة الشبكية أرنب الكبار

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

التسليم المباشر للMorpholinos MIF في Otocyst اسماك الزرد عن طريق الحقن وElectroporation يؤثر على التنمية الداخلية الأذن

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...