يمكن لاستراتيجية كروماتوغرافيا تقارب المعادن المزدوجة الوظائف من التيتانيوم أن تثري كلا من N-glycopeptides و phosphopeptides في نفس سير العمل ، مما يزيد من المعلومات الجزيئية الحيوية من نفس التحليل. الميزة الرئيسية لهذا التخصيب هي آليتان للفصل ، مما يتيح الفصل المتزامن بين N-glycopeptides و phosphopeptides في كسور منفصلة لتحليل الطيف الكتلي في المصب. يمكن أن يؤدي استخدام طريقة التخصيب هذه إلى تحسين الكشف عن الجليكوزيل والفسفرة في العينات البيولوجية المعقدة مثل أنسجة البنكرياس نحو اكتشاف المؤشرات الحيوية للأمراض كما هو الحال في مرض السكري والسرطان.
نظرا لأن هذه الطريقة تعتمد على أطراف الدوران والطرد المركزي ، فمن المهم التحكم في سرعة الطرد المركزي ، والتأكد من أن العينات خالية من الجسيمات لمنع أي انسداد. للبدء ، قم بتبريد أجزاء طاحن الأنسجة التي ستلامس أنسجة البنكرياس مسبقا ، وهي الغرفة والطاحن وملعقة الاسترداد ، إلى جانب أي ملاعق ، في حاوية بوليسترين. بعد ذلك ، انقل قطع الأنسجة إلى حامل العينة المبرد مسبقا ، وأضف النيتروجين السائل إلى الأنسجة حتى يتم تجميدها.
بعد وضع الساحق في الغرفة ، اضربه باستخدام مطرقة خمس إلى عشر مرات لسحق العينة ، ثم قم بإزالة الساحق من الغرفة وكشط مسحوق الأنسجة الملتصقة والقطع. بعد ذلك ، أضف ملعقة من النيتروجين السائل إلى الغرفة إذا بدأت الأنسجة في الذوبان ، وكرر عملية السحق حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم وقسم العينات إلى ما يقرب من 100 ملليغرام أليكوت في أنابيب مبردة مسبقا. بعد تحضير المخزن المؤقت للتحلل ، قم بإذابة قرص واحد لكل من مثبط البروتياز والفوسفاتيز في 500 ميكرولتر من الماء ، للحصول على مخزون يبلغ 20 ضعف التركيز النهائي المطلوب ، وأضف الحجم المطلوب من المخزون لكل مثبط إلى مخزن التحلل العازل لتحقيق تركيزات المثبط النهائية.
بعد إضافة 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى الأنبوب ، احتضن عند 95 درجة مئوية في كتلة التسخين لمدة 10 دقائق مع الاهتزاز عند 800 دورة في الدقيقة ، ثم قم بإزالة العينات من كتلة التسخين واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بصوتنة العينات بطاقة 60 واط لمدة 45 ثانية ، باستخدام نبضات 15 ثانية مع راحة لمدة 30 ثانية بينهما ، وقم بتكوير العينات بسرعة 3000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أضف السوبرناتانت إلى خمسة أضعاف حجم مذيب هطول الأمطار.
على سبيل المثال ، 300 ميكرولتر من التحلل العازل إلى 1.5 ملليلتر من مذيب هطول الأمطار الذي يحتوي على 50٪ من الأسيتون و 49.9٪ من الإيثانول و 0.1٪ من حمض الخليك ، ثم يبرد بين عشية وضحاها عند 80 درجة مئوية. قم بتكوير العينات مرة أخرى عند 3000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وإزالة supernatant ، ثم غسل الكريات عن طريق تفتيتها بملعقة وتخلط مع نفس الكمية من مذيب هطول الأمطار. بعد الطرد المركزي ، جفف حبيبات العينة في الهواء في غطاء دخان لمدة 15 دقيقة ، وخزنها عند 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
أولا ، أعد تعليق بيليه البروتين في 300 ميكرولتر من مخزن الهضم العازل الطازج الذي يحتوي على 50 ملليمولار ثلاثي إيثيلامونيوم بيكربونات عازلة وثمانية يوريا مولية. إلى البروتين الموجود في المحلول ، أضف ثنائي ثيوثريتول إلى تركيز نهائي من خمسة ملليمولار ، واخلطه ، وقلله في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، ثم أضف يودواسيتاميد إلى تركيز نهائي عند 15 ملليمولار. تخلط ، والألكيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
بعد ذلك ، أضف Lys-C / Trypsin بنسبة 1 إلى 100 من الإنزيم إلى البروتين ، واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة أربع ساعات ، ثم أضف 50 ملليمولار ثلاثي إيثيلامونيوم بيكربونات العازلة لتخفيف اليوريا المولية الثمانية المستخدمة إلى أقل من ضرس واحد. بعد إضافة التربسين بنسبة 1 إلى 100 إنزيم إلى بروتين ، احتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة بين عشية وضحاها ، ثم قم بإخماد عملية الهضم بإضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. لكل ملليغرام واحد من بروتين البدء ، قم بتهيئة خرطوشة تحلية المياه مع ملليلتر واحد من الأسيتونيتريل ، وثلاث مرات مع ملليلتر واحد من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ ، ثم قم بتحميل الخليط المهضوم على خرطوشة إزالة الملح ، واغسل الخليط ثلاث مرات باستخدام ملليلتر واحد من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪.
بعد ذلك ، الببتيدات الألوية باستخدام ملليلتر واحد من 60٪ من الأسيتونيتريل ومحلول حمض الفورميك 0.1٪ ، ثم جفف الببتيدات المطفأة عند حوالي 35 درجة مئوية باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي حتى يتبخر المذيب تماما. بعد إعادة تعليق الببتيدات في الماء ، قم بتقدير تركيزات الببتيد باستخدام فحص الببتيد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، ثم قسم الببتيدات إلى أليكوتس 500 ميكروغرام ، وجففها تماما. يزن ما يقرب من ثلاثة ملليغرام من الصوف القطني ويعبئه في طرف دوار فارغ.
بعد نقل غرام واحد من مادة كروماتوغرافيا التقارب المعدني المجمدة من التيتانيوم إلى أنبوب ، أضف 0.1٪ من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى تركيز معروف من المواد. بعد إضافة ما يكفي من الطين إلى طرف الدوران لنقل 20 ملليغرام من المواد ، اغسل طرف الدوران عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪. أعد تعليق العينات في 200 ميكرولتر من مذيب التحميل / الغسيل ، واتدفق عبر طرف الدوران.
بعد غسل طرف الدوران عن طريق الطرد المركزي باستخدام مذيب التحميل / الغسيل ، اغسل طرف الدوران ب 200 ميكرولتر من محلول حمض الفورميك 0.1 الأسيتونيتريل بنسبة 80٪ ، ثم قم بإخراج الببتيدات ب 200 ميكرولتر من E1 و E2 ، وقم بتحليل كل استخلاص على حدة. كرر عملية الاستخلاص باستخدام المذيبات E3 و E4 ، واجمع بين كسور الاستخلاص المناسبة قبل التحليل النهائي. قبل إجراء عمليات الاستخلاص عند درجة الحموضة الأساسية ، قم بتكييف المادة ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من 90٪ من الأسيتونيتريل في هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 2.5٪ ، ثم قم بتصفية الببتيدات باستخدام 200 ميكرولتر من مذيبات E5 و E6 ، وقم بتحليل هذه الاستخلاصات بشكل منفصل بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
بعد ذلك ، قم بتميص الببتيدات ب 200 ميكرولتر بتركيزات مختلفة من الأسيتونيتريل وهيدروكسيد الأمونيوم. بعد ذلك ، اجمع بين هذه التخفيفات ، وقم بتحليلها كعينة واحدة ، E7 ، بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ. وتم الحصول على أطياف MS/MS المشروحة عالية الثقة من الببتيدات N-glycosylated والمفسفرة مع تجزئة غنية للسلائف، مما زاد من الثقة في تحديد الهوية، على النحو الذي حددته برامجيات البحث في قواعد البيانات.
تم العثور على تحديدات الببتيد من العينات المخصب باستخدام طريقة دوران الكروماتوغرافيا المعدنية المزدوجة التقارب المعدني التيتانيوم على كل جزء من أجزاء الخروج. غالبية الببتيدات السكرية تعود في الكسور الأربعة الأولى ، في حين أن غالبية الببتيدات الفوسفوببتيدات تعود في الكسور الثلاثة الأخيرة ، مما يقلل من التداخلات المحتملة في التأين. تمت مقارنة نتائج glycoproteomics من طريقة التيتانيوم المزدوج مع إثراء Ehrlich-glycopeptide فقط ، مما يدل على أن نسب كل نوع من أنواع الغليكان بعد الربط في ست فئات بناء على تركيباتها ، متشابهة بين كلتا الطريقتين.
تمت مقارنة نتائج الفوسفوبروتينات من طريقة التيتانيوم المزدوجة مع التخصيب التقليدي للتقارب المعدني المجمد الكروماتوغرافي الفوسفوبتيد فقط أو باستخدام كلتا الطريقتين. تم تحديد غالبية الأحماض الأمينية المفسفرة على أنها سيرين وثريونين ، مع حوالي 1٪ من التيروزين المفسفر. يعد بناء طرف الدوران بشكل صحيح أمرا مهما لضمان الذوبان السلس.
قم بتوصيل القطن بإحكام في الطرف ، بحيث يمكن تعبئة مادة التخصيب فوق القطن. لقد استخدمنا طريقة التيتانيوم المزدوج الوظائف IMAC للتوصيف المتزامن للغليكوزيل والفسفرة في معظم الأنسجة وبروتين سبايك SARS-CoV-2.
