Çift fonksiyonlu Titanyum immobilize metal afinitesi kromatografisi stratejisi, aynı iş akışında hem N-glikopeptidleri hem de fosfopeptidleri zenginleştirerek aynı analizden biyomoleküler bilgileri artırabilir. Bu zenginleştirmenin temel avantajı, aşağı akış kütle spektrometrisi analizi için N-glikopeptidlerin ve fosfopeptitlerin ayrı fraksiyonlarda eşzamanlı olarak ayrılmasını sağlayan iki ayırma mekanizmasıdır. Bu zenginleştirme yönteminin kullanılması, pankreas dokuları gibi karmaşık biyolojik örneklerde glikozilasyon ve fosforilasyonun tespitini, diyabet ve kanser gibi hastalık biyobelirteçlerinin keşfine doğru iyileştirebilir.
Bu yöntem spin uçlarına ve santrifüjlemeye dayandığından, santrifüjleme hızını kontrol etmek ve herhangi bir tıkanmayı önlemek için numunelerin partikül içermediğinden emin olmak önemlidir. Başlamak için, pankreas dokularıyla, yani oda, pulverizatör ve geri kazanım kaşığıyla, herhangi bir spatulayla birlikte, bir polistiren kapta temas edecek doku öğütücünün parçalarını önceden soğutun. Daha sonra, doku parçalarını önceden soğutulmuş numune tutucuya aktarın ve dondurulana kadar dokuya sıvı bir azot ekleyin.
Öğütücüyü odaya yerleştirdikten sonra, numuneyi ezmek için beş ila on kez bir tokmak kullanarak vurun, ardından öğütücüyü odadan çıkarın ve yapışkan doku tozunu ve parçalarını kazıyın. Daha sonra, dokular erimeye başlarsa odaya bir kaşık sıvı azot ekleyin ve ince bir toz elde edilene kadar pulverizasyon işlemini tekrarlayın ve numuneleri önceden soğutulmuş tüplere yaklaşık 100 miligramlık alikotlara bölün. Lizis tamponunu hazırladıktan sonra, istenen nihai konsantrasyonun 20 katı bir stok için proteaz ve fosfataz inhibitörünün her biri bir tableti 500 mikrolitre suda çözün ve nihai inhibitör konsantrasyonlarını elde etmek için her bir inhibitörün gerekli stok hacmini lizis tamponuna ekleyin.
Tüpe 600 mikrolitre lizis tamponu ekledikten sonra, 800 RPM'de çalkalayarak 10 dakika boyunca ısıtma bloğunda 95 santigrat derecede inkübe edin, ardından numuneleri ısıtma bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Daha sonra, örnekleri 45 saniye boyunca 60 Watt enerjide sonikleştirin, aralarında 30 saniyelik bir dinlenme ile 15 saniyelik darbeler kullanın ve örnekleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 3000 kez G'de toplayın. Süpernatantı çökeltme çözücüsünün hacminin beş katına ekleyin.
Örneğin,% 50 aseton,% 49,9 etanol ve% 0,1 asetik asit içeren 1,5 mililitre çökeltme çözücüsüne 300 mikrolitre lizis tamponu, daha sonra 80 santigrat derecede gece boyunca soğutun. Numuneleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 3000 kez G'de tekrar toplayın ve süpernatanı çıkarın, ardından bir spatula ile parçalayarak peleti yıkayın ve aynı miktarda çökeltme çözücüsü ile karıştırın. Santrifüjlemeden sonra, numune peletini 15 dakika boyunca bir duman davlumbazında hava ile kurutun ve ilerlemeye hazır olana kadar 80 santigrat derecede saklayın.
İlk olarak, protein peletini 50 milimolar trietilammonyum bikarbonat tamponu ve sekiz molar üre içeren 300 mikrolitre taze yapılmış sindirim tamponunda yeniden askıya alın. Çözelti içindeki proteine, beş milimolar'lık son bir konsantrasyona ditiyotreitol ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat azaltın, ardından 15 milimolar'daki son konsantrasyona iyodoasetamid ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın ve alkilat yapın.
Daha sonra, 1 ila 100 enzim-protein oranında Lys-C / Tripsin ekleyin ve dört saat boyunca bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin, ardından bir azı dişinden daha azına kullanılan sekiz molar üreyi seyreltmek için 50 milimolar trietilammonyum bikarbonat tamponu ekleyin. 1 ila 100 enzim-protein oranında tripsin ekledikten sonra, gece boyunca bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin, daha sonra trifloroasetik asit ilavesiyle sindirimi söndürün. Her bir miligram başlangıç proteini için, bir mililitre asetonitril içeren bir tuzdan arındırma kartuşu ve bir mililitre% 0.1 trifloroasetik asit ile üç kez şartlandırın, ardından sindirilmiş karışımı tuzdan arındırma kartuşuna yükleyin ve karışımı bir mililitre% 0.1 trifloroasetik asit kullanarak üç kez yıkayın.
Daha sonra, bir mililitre% 60 asetonitril ve% 0.1 formik asit çözeltisi kullanarak salınımlı peptitleri salın, daha sonra çözücü tamamen buharlaşana kadar bir santrifüjlü vakum yoğunlaştırıcı kullanarak yaklaşık 35 santigrat derecede salınımlı peptitleri kurutun. Peptitleri suda yeniden askıya aldıktan sonra, üreticinin protokolüne göre bir peptit testi kullanarak peptid konsantrasyonlarını tahmin edin, ardından peptidleri 500 mikrogramlık alikotlara bölün ve tamamen kurutun. Yaklaşık üç miligram pamuk yünü tartın ve boş bir sıkma ucuna koyun.
Bir gram Titanyum immobilize metal afinite kromatografisi malzemesini bir tüpe aktardıktan sonra, bilinen bir malzeme konsantrasyonuna% 0.1 trifloroasetik asit ekleyin. 20 miligram malzeme aktarmak için bir sıkma ucuna yeterli bulamaç ekledikten sonra, sıkma ucunu 200 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ile santrifüj ederek yıkayın. Numuneleri 200 mikrolitre yükleme/yıkama çözücüsü içinde tekrar askıya alın ve sıkma ucundan akın.
Spin ucunu yükleme/yıkama çözücüsü ile santrifüjleme ile yıkadıktan sonra, spin ucunu 200 mikrolitre% 80 asetonitril 0.1 formik asit çözeltisi ile yıkayın, ardından peptidleri 200 mikrolitre E1 ve E2 ile süzün ve her bir elüsyonu ayrı ayrı analiz edin. E3 ve E4 çözücüleri kullanarak elüsyon işlemini tekrarlayın ve aşağı akış analizinden önce uygun elüsyon fraksiyonlarını birleştirin. Elutyonları temel pH'da gerçekleştirmeden önce, malzemeyi% 2.5 amonyum hidroksit içinde 200 mikrolitre% 90 asetonitril kullanarak üç kez şartlandırın, daha sonra peptitleri 200 mikrolitre E5 ve E6 çözücü ile süzün ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bu salınımları ayrı ayrı analiz edin.
Daha sonra, peptitleri 200 mikrolitre farklı konsantrasyonlarda asetonitril ve amonyum hidroksit ile etkisiz hale getirin. Daha sonra, bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra tek bir numune olan E7 olarak analiz edin. N-glikozile ve fosforile peptitlerden gelen açıklamalı yüksek güvenilirlikli MS / MS spektrumları, öncüllerin zengin parçalanması ile elde edildi ve veritabanı arama yazılımı tarafından atandığı gibi tanımlamaya olan güveni artırdı.
Peptit tanımlamaları, her bir elüsyon fraksiyonu üzerinde çift fonksiyonlu Titanyum immobilize metal afinite kromatografisi spin ucu yöntemi kullanılarak zenginleştirilmiş örneklerden bulunmuştur. Glikopeptidlerin çoğunluğu ilk dört fraksiyonda süzülürken, fosfopeptidlerin çoğunluğu son üç fraksiyonda süzülür ve iyonizasyondaki potansiyel parazitleri azaltır. İkili titanyum yönteminden elde edilen glikoproteomik sonuçlar, sadece Ehrlich-glikopeptid zenginleştirme ile karşılaştırıldı ve bileşimlerine göre altı kategoriye bağlandıktan sonra her bir glikan tipinin oranlarının her iki yöntem arasında benzer olduğunu gösterdi.
İkili titanyum yönteminden elde edilen fosfoproteomik sonuçlar, geleneksel immobilize metal afinite kromatografisi fosfopeptid zenginleştirme ile karşılaştırıldı veya her iki yöntem de kullanıldı. Fosforile amino asitlerin çoğunluğu serin ve treonin olarak tanımlandı ve yaklaşık% 1 fosforile tirozin ile tanımlandı. Sıkma ucunun düzgün bir şekilde yapılandırılması, pürüzsüz elüsyon sağlamak için önemlidir.
Pamuğu ucuna sıkıca takın, böylece zenginleştirme malzemesi pamuğun üzerine paketlenebilir. Çoğu dokuda glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı karakterizasyonu ve SARS-CoV-2 spike proteini için çift fonksiyonlu titanyum IMAC yöntemini kullandık.
