双功能钛固定化金属亲和色谱策略可以在同一工作流程中同时富集N-糖肽和磷肽，从而增加相同分析的生物分子信息。这种富集的主要优点是两种分离机制，可以同时分离分离分离的N-糖肽和磷酸肽，用于下游质谱分析。使用这种富集方法可以改善复杂生物样品（如胰腺组织）中糖基化和磷酸化的检测，以发现疾病生物标志物，例如在糖尿病和癌症中。
由于这种方法依赖于自旋吸头和离心，因此控制离心速度并确保样品不含颗粒以防止任何堵塞非常重要。首先，在聚苯乙烯容器中预冷将与胰腺组织接触的组织粉碎器部分，即腔室，粉碎机和恢复勺，以及任何刮刀。接下来，将组织块转移到预冷的样品架中，并向组织中加入液氮，直到它们被冷冻。
将粉碎机放入腔室后，用木槌敲击五到十次以粉碎样品，然后从腔室中取出粉碎器并刮掉粘附的组织粉末和碎片。接下来，如果组织开始融化，则向腔室中加入一勺液氮，并重复粉碎过程，直到获得细粉，并将样品分成约100毫克等分试样到预冷管中。制备裂解缓冲液后，将蛋白酶和磷酸酶抑制剂各一片溶于500微升水中，培养液为所需最终浓度的20倍，并向裂解缓冲液中加入每种抑制剂所需体积的储备液，以达到最终的抑制剂浓度。
向管中加入600微升裂解缓冲液后，在加热块中以95摄氏度孵育10分钟，以800 RPM振荡，然后从加热块中取出样品并使其冷却至室温。接下来，使用15秒脉冲以60瓦能量超声处理样品45秒，中间休息30秒，并在4摄氏度下以3000倍G沉淀样品15分钟。将上清液加入其沉淀溶剂体积的五倍。
例如，将300微升裂解缓冲液放入含有50%丙酮、49.9%乙醇和0.1%乙酸的1.5毫升沉淀溶剂中，然后在80摄氏度下冷却过夜。在4摄氏度下以3000倍G再次沉淀样品15分钟，并除去上清液，然后用刮刀破碎洗涤沉淀，并与相同量的沉淀溶剂混合。离心后，将样品颗粒在通风橱中风干15分钟，并在80摄氏度下储存，直到准备继续。
首先，将蛋白质沉淀重新悬浮在含有50毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液和8摩尔尿素的300微升新鲜消化缓冲液中。对于溶液中的蛋白质，加入二硫代肌醇至终浓度为5毫摩尔，混合，并在室温下还原一小时，然后加入碘乙酰胺至终浓度为15毫摩尔。混合，并在室温下在黑暗中烷基化30分钟。
接下来，以1至100的酶蛋白比例加入Lys-C / Trypsin，并在37摄氏度的培养箱中孵育4小时，然后加入50毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液，将用于的八摩尔尿素稀释至小于一摩尔。以1至100的酶蛋白比加入胰蛋白酶后，在37摄氏度的培养箱中孵育过夜，随后通过加入三氟乙酸淬灭消化。对于每1毫克起始蛋白，用一毫升乙腈调节脱盐盒，用一毫升0.1%三氟乙酸调节三次，然后将消化的混合物装入脱盐盒上，并使用一毫升0.1%三氟乙酸洗涤混合物三次。
接下来，使用一毫升60%乙腈和0.1%甲酸溶液洗脱肽，然后使用离心真空浓缩器在约35摄氏度下干燥洗脱肽，直到溶剂完全蒸发。将肽重新悬浮在水中后，根据制造商的方案使用肽测定法估计肽浓度，然后将肽分成500微克等分试样，并完全干燥。称取约三毫克棉絮，并将其包装成空的纺丝头。
将一克钛固定化金属亲和色谱材料转移到管中后，向已知浓度的材料中加入0.1%的三氟乙酸。在向离心头中加入足够的浆料以转移20毫克材料后，用200微升的0.1%三氟乙酸离心洗涤离心自旋尖端。将样品重新悬浮在200微升的上样/洗涤溶剂中，并流过旋转尖端。
用加载/洗涤溶剂离心洗涤旋转尖端后，用200微升80%乙腈0.1甲酸溶液洗涤离心尖端，然后用200微升E1和E2洗脱肽，并分别分析每个洗脱液。使用E3和E4溶剂重复洗脱过程，并在下游分析前合并适当的洗脱级分。在碱性pH下进行洗脱之前，使用200微升90%乙腈在2.5%氢氧化铵中调节材料三次，然后用200微升E5和E6溶剂洗脱肽，并在使用填充的尖端脱盐后分别分析这些洗脱液。
接下来，用200微升不同浓度的乙腈和氢氧化铵洗脱肽。然后，将这些洗脱液混合，并在使用填充的吸头脱盐后作为一个样品E7进行分析。从N-糖基化和磷酸化肽中获得注释的高置信度MS / MS光谱，具有丰富的前体片段化，增加了数据库搜索软件分配的鉴定信心。
从使用双功能钛固定化金属亲和色谱自旋尖端法对每个洗脱级数富集的样品中发现肽鉴定。大多数糖肽在前四个级分中洗脱，而大多数磷酸肽在最后三个级分中洗脱，从而减少电离中的潜在干扰。将双钛法的糖蛋白质组学结果与仅富含Ehrlich-糖肽的结果进行比较，证明根据其组成将每种聚糖分集后每种类型的聚糖的比例分为六类，在两种方法之间是相似的。
将双钛法的磷酸化蛋白质组学结果与常规的固定化金属亲和色谱法进行比较，仅使用磷酸肽富集或同时使用这两种方法。大多数磷酸化氨基酸被鉴定为丝氨酸和苏氨酸，其中约1%磷酸化酪氨酸。正确构建自旋尖端对于确保平滑洗脱非常重要。
将棉花牢固地塞入尖端，以便将浓缩材料包装在棉花的顶部。我们使用双功能钛IMAC方法同时表征大多数组织中的糖基化和磷酸化以及SARS-CoV-2刺突蛋白。
