이중 기능성 티타늄 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 전략은 동일한 워크플로우에서 N-글리코펩티드와 포스포펩타이드를 모두 풍부하게 하여 동일한 분석에서 생체분자 정보를 증가시킬 수 있습니다. 이러한 농축의 주요 이점은 하류 질량 분광법 분석을 위해 별도의 분획에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드를 동시에 분리할 수 있는 두 가지 분리 메커니즘이다. 이러한 농축 방법을 사용하면 당뇨병 및 암과 같은 질병 바이오마커 발견을 향한 췌장 조직과 같은 복잡한 생물학적 샘플에서 글리코실화 및 인산화의 검출을 향상시킬 수 있다.
이 방법은 스핀 팁과 원심분리에 의존하기 때문에 원심분리 속도를 제어하고 막힘을 방지하기 위해 샘플에 미립자가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 시작하려면 췌장 조직과 접촉 할 조직 분쇄기의 부분, 즉 챔버, 분쇄기 및 회복 숟가락을 주걱과 함께 폴리스티렌 용기에 미리 식히십시오. 다음으로, 조직 조각을 미리 냉각된 샘플 홀더로 옮기고, 동결될 때까지 조직에 액체 질소를 첨가한다.
분쇄기를 챔버 내로 넣은 후, 다섯 번 내지 열 번 망치를 사용하여 샘플을 분쇄한 다음, 챔버에서 분쇄기를 제거하고 부착성 조직 분말 및 조각을 긁어낸다. 다음으로, 조직이 녹기 시작하면 챔버에 액체 질소 한 숟가락을 첨가하고, 미세 분말이 얻어질 때까지 분쇄 과정을 반복하고 샘플을 약 100 밀리그램의 분취량으로 미리 냉각 된 튜브에 분배하십시오. 용해 완충액을 준비한 후, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 각각의 정제를 500 마이크로리터의 물에 용해시키고, 원하는 최종 농도의 20배의 스톡을 위해, 용해 완충액에 각 억제제의 필요한 부피의 스톡을 첨가하여 최종 억제제 농도를 달성한다.
튜브에 600 마이크로리터의 용해 완충액을 첨가한 후, 800 RPM에서 10분 동안 가열 블록에서 섭씨 95도에서 인큐베이션한 다음, 가열 블록으로부터 샘플을 제거하고 실온으로 냉각시킨다. 다음으로, 샘플을 60와트 에너지로 45초 동안 초음파 처리하고, 그 사이에 30초 동안 15초 동안 15초 동안 정지하고, 섭씨 4도에서 15분 동안 3000배 G에서 샘플을 펠릿화한다. 상청액을 침전 용매의 다섯 배에 첨가하십시오.
예를 들어, 300 마이크로리터의 용해 완충액을 50% 아세톤, 49.9% 에탄올 및 0.1% 아세트산을 함유하는 침전 용매 1.5 밀리리터에 넣은 다음, 섭씨 80도에서 밤새 냉각시킨다. 샘플을 섭씨 네 도에서 15분 동안 3000배 G에서 펠릿화하고, 상층액을 제거한 다음, 주걱으로 분해하여 펠렛을 세척하고 동일한 양의 침전 용매와 혼합한다. 원심분리 후, 샘플 펠렛을 흄 후드에서 15분 동안 공기 건조시키고, 진행될 준비가 될 때까지 섭씨 80도에서 보관한다.
먼저, 단백질 펠릿을 50 밀리몰 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액 및 8몰 우레아를 함유하는 갓 만든 소화 완충액 300 마이크로리터에 재현탁시킨다. 용액 중의 단백질에 디티오트레이톨을 5 밀리몰의 최종 농도로 첨가하고, 실온에서 한 시간 동안 혼합하고 감소시킨 다음, 요오도아세트아미드를 15 밀리몰의 최종 농도로 첨가한다. 혼합하고, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 알킬레이트한다.
다음으로, Lys-C/트립신을 효소 대 단백질 비율 1 내지 100으로 첨가하고, 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 네 시간 동안 배양한 다음, 50밀리몰 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액을 첨가하여 사용된 8몰 우레아를 1몰 미만으로 희석한다. 트립신을 효소 대 단백질 비율 1 내지 100으로 첨가한 후, 하룻밤 동안 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 인큐베이션하고, 이어서 트리플루오로아세트산을 첨가하여 소화를 켄칭한다. 시작 단백질 1 밀리그램마다 탈염 카트리지를 1 밀리리터의 아세토니트릴로 컨디셔닝하고 0.1 % 트리플루오로 아세트산 1 밀리리터로 세 번 넣은 다음 소화 된 혼합물을 탈염 카트리지에로드하고 0.1 % 트리플루오로 아세트산 1 밀리리터를 사용하여 혼합물을 세 번 세척하십시오.
다음으로, 60%아세토니트릴 1밀리리터와 0.1%포름산 용액을 사용하여 펩티드를 용출시키고, 용출된 펩티드를 용매가 완전히 증발될 때까지 원심 진공 농축기를 사용하여 대략 섭씨 35도에서 건조시킨다. 펩티드를 물에 재현탁시킨 후, 제조자의 프로토콜에 따라 펩티드 검정을 사용하여 펩티드 농도를 추정한 다음, 펩티드를 500-마이크로그램 분취량으로 분할하고, 완전히 건조시킨다. 약 세 밀리그램의 면봉의 무게를 측정하여 빈 스핀 팁에 포장하십시오.
티타늄 고정화 된 금속 친화성 크로마토그래피 물질 1 그램을 튜브로 옮긴 후 0.1 % 트리 플루오로 아세트산을 알려진 농도의 물질에 첨가하십시오. 스핀 팁에 충분한 슬러리를 첨가하여 20 밀리그램의 물질을 옮긴 후 0.1 % 트리플루오로 아세트산 200 마이크로 리터로 원심분리하여 스핀 팁을 세척하십시오. 샘플을 200 마이크로리터의 로딩/세척 용매에 재현탁하고 스핀 팁을 통해 흐릅니다.
로딩/세척 용매로 원심분리하여 스핀 팁을 세척한 후, 스핀 팁을 80% 아세토니트릴 0.1 포름산 용액 200 마이크로리터로 세척한 다음, 200 마이크로리터의 E1 및 E2로 펩티드를 용출시키고, 각각의 용출을 개별적으로 분석한다. E3 및 E4 용매를 사용하여 용출 과정을 반복하고, 하류 분석 전에 적절한 용출 분획을 조합한다. 염기성 pH에서 용출을 수행하기 전에, 2.5% 수산화암모늄 중의 90% 아세토니트릴 200 마이크로리터를 사용하여 물질 세리스를 조건화한 다음, 200 마이크로리터의 E5 및 E6 용매로 펩티드를 용출시키고, 포장된 팁을 사용하여 탈염 후 이들 용출을 개별적으로 분석한다.
다음으로, 아세토니트릴과 수산화 암모늄의 상이한 농도의 200 마이크로리터로 펩티드를 용출시킨다. 그 후, 이들 용출액을 결합하고, 패킹된 팁을 사용하여 탈염 후 하나의 샘플, E7로서 분석한다. N-글리코실화 및 인산화된 펩티드로부터의 주석이 달린 고신뢰도 MS/MS 스펙트럼은 전구체의 풍부한 단편화로 얻어졌으며, 데이터베이스 검색 소프트웨어에 의해 할당된 바와 같이 식별에 대한 신뢰도를 증가시켰다.
펩티드 동정은 각 용출 분획에 걸쳐 이중 작용성 티타늄 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 스핀 팁 방법을 사용하여 농축된 샘플로부터 발견되었다. 대부분의 글리코펩티드는 처음 네 개의 분획에서 용출되는 반면, 대부분의 포스포펩티드는 마지막 세 분획에서 용출되어 이온화에 대한 잠재적인 간섭을 감소시킨다. 이중 티타늄 방법의 글리코 프로테오믹스 결과는 Ehrlich-glycopeptide-only 농축과 비교되었으며, 이는 그들의 조성에 따라 여섯 가지 범주로 비닝 한 후 각 유형의 글리 칸의 비율이 두 방법 사이에서 유사하다는 것을 보여줍니다.
이중 티타늄 방법으로부터의 포스포프로테오믹스 결과는 종래의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 포스포펩티드-농축 또는 두 가지 방법 모두를 사용하여 비교되었다. 인산화 아미노산의 대부분은 세린과 트레오닌으로 확인되었으며, 약 1%의 인산화된 티로신이 있었다. 원활한 용출을 보장하기 위해 스핀 팁을 적절하게 구성하는 것이 중요합니다.
농축 재료를 면화 위에 포장 할 수 있도록 면화를 팁에 단단히 꽂으십시오. 우리는 대부분의 조직과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에서 글리코실화 및 인산화의 동시 특성화를 위해 이중 기능 티타늄 IMAC 방법을 사용했습니다.
