يحتوي الجلد على أنواع متعددة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية وخلايا شوان العصبية. يسمح هذا البروتوكول بعزل كل نوع من أنواع الخلايا هذه للتجارب في المختبر. يسمح عزل وإنشاء مزارع الخلايا الأولية الفردية من متبرع واحد بإجراء مقارنات قوية وتجارب الزراعة المشتركة ، مع التخفيف من آثار التباين الجيني.
باستخدام هذا البروتوكول ، يسمح تحليل الخلايا الفردية وتفاعلاتها بتحليل دور خلايا Schwann في توازن الجلد والفيزيولوجيا المرضية. يمكن استخدام مجموعات الخلايا المتميزة هذه لدراسة خلايا شوان أو الخلايا الليفية أو الخلايا الكيراتينية إما بشكل فردي أو مجتمعة في فسيولوجيا الجلد الطبيعية أو التئام الجروح أو في الحالات المريضة بالجلد. سيساعدني Jagadeeshaprasad M G ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري ، في إظهار الإجراء.
بعد الحصول على القلفة الوليدية باتباع إجراءات الرعاية القياسية ، ضع القلفة المستأصلة في أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على ثمانية إلى 10 ملليلتر من الوسط القاعدي DMEM البارد ، وانقل القلفة على الفور إلى مختبر زراعة الخلايا لعزل الخلايا. شطف القلفة مرتين مع 20 إلى 25 ملليلتر من دولبيكو الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة أو DPBS ، التي تحتوي على المضادات الحيوية ومضادات الفطريات. ثم انقع الجلد المغسول في 25 إلى 30 ملليلتر من وسط DMEM القاعدي البارد في طبق زراعة الأنسجة 10 سم.
بعد 15 دقيقة ، افتح القلفة باستخدام مشرط لفضح الأدمة والأنسجة الدهنية تحت الجلد. استخدم الملقط وشفرة المشرط والمقص لإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد والتخلص منها. ثم قطع القلفة النظيفة إلى ثلاث إلى خمس قطع أصغر واحتضن قطع الجلد في 16 إلى 20 ملليلتر من Dispace one DMEM الوسط في أنبوب مخروطي معقم.
خلال أول 30 دقيقة من الحضانة مع Dispace ، امزج المرء بشكل متقطع قطع الجلد في الأنبوب المخروطي عن طريق الانعكاس. ثم ضع الأنبوب المخروطي عند أربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة قطع الجلد ووضعها على طبق ثقافة معقم جاف وقم بفتح كل قطعة من الجلد بحيث تلامس طبقة البشرة الخارجية طبق الثقافة.
بدءا من حافة الأنسجة قشر البشرة بعيدا عن الأدمة باستخدام مجموعتين من الملقط. أضف شظايا البشرة المنفصلة إلى خمسة ملليلترات من HBS في طبق استزراع طوله 10 سنتيمترات لتحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم جمع محلول HBS في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وإضافة خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحييد التربسين أو T و B في الأنبوب المخروطي.
ضع الأنبوب جانبا. إلى شظايا البشرة في طبق الثقافة أضف ثلاثة ملليلترات من محلول التربسين لاحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بتحريك شظايا البشرة بلطف باستخدام ملقط حتى يصبح محلول الخلايا الكيراتينية التربسين عكرا.
بعد ذلك أضف محلول الخلايا الكيراتينية التربسين إلى أنبوب HBS T و B. بعد إذابة شظايا البشرة غير المهضومة بمحلول التربسين EDTA ، أضف ملليلترين من FBS إلى أنبوب HBS T و B الذي يحتوي على محلول التربسين EDTA ، وقم بالطرد المركزي للاثنين حوالي 870 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بشفط السوبرناتانت وإعادة تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة ملليلتر من وسط النمو الكامل للخلايا الكيراتينية ، يليه ترشيح تعليق الخلية بمرشح معقم 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر.
بمجرد تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلية كميا ، قم بزرع الخلايا في ألواح الزراعة لوضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين ، قم بشفط الخلايا غير الملتصقة ، وقم بتحديث وسائط زراعة الخلايا كل يومين حتى تصل الخلايا الكيراتينية إلى التقاء 50 إلى 80٪ للتجارب العابرة أو النهائية. قم بتغطية قوارير T25 بالبولي إل ليسين أو PLL ، باستخدام خمسة ملليلترات من DPBS ووضع القوارير المطلية مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.
في وقت لاحق غسل مصفوفة طلاء PLL مرتين مع DPBS. بعد غسل القطع المعزولة من الأدمة بخمسة ملليلتر من الوسط القاعدي DMEM ، قم بتقطيع الأدمة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص. هضم الأدمة المفرومة مع خمسة ملليلتر من الكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ونصف ، مع معايرة لطيفة باستخدام طرف ماصة كل 30 دقيقة حتى تنفصل الأدمة تماما.
بمجرد هضمه ، قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، تليها تخفيف تعليق الخلية المصفى بخمسة ملليلترات من وسط DMEM الكامل لوقف النشاط الأنزيمي للكولاجيناز. بعد ذلك ، يقوم الطرد المركزي بتعليق الخلية عند 870 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ويعيد تعليق اقتراع الخلية في ملليلترين من DMEM وسط كامل لتقسيم الخلايا. بعد تكرار عملية التمركز كما هو موضح ، قم بشفط supernatant لاستخدام بيليه الخلية لعزل خلايا Schwann أو الخلايا الليفية.
لعزل خلايا شوان ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلترات من متوسط DMEM الكامل الطازج وحدد عدد الخلايا وقابليتها للحياة قبل بذر خمسة ملليلترات من الخلايا المعاد تعليقها في قوارير T25 المشفرة مسبقا بكثافة 4.0 في 10 إلى الخلايا الثلاث لكل ملليلتر. احتضن القارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 16 ساعة تأكد من التصاق الخلايا عن طريق الفحص المجهري عند تكبير 10X.
ثم قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة واغسل القارورة ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من DPBS. بعد ذلك احتضان الخلايا مع خمسة ملليلتر من 10 ميكرومولار سيتوسين أرابينوسيد في وسط DMEM كامل. بعد 24 ساعة ، قم بشفط أرابينوسيد السيتوزين الذي يحتوي على وسط قبل شطف القارورة كما هو موضح من قبل.
أعد ملء قارورة الزرع بخمسة ملليلترات من خلايا شوان لإكمال وسط الزرع لاحتضان 48 ساعة ، مع تحديث الوسط كل يومين حتى تصل خلايا شوان إلى 80٪ من التقاء. لعزل الخلايا الليفية ، أعد تعليق الكريات المجمعة في خمسة ملليلترات من الخلايا الليفية الكاملة المتوسطة. لزراعة الخلايا في قوارير ثقافة T25 غير المشفرة لمدة 24 ساعة كما هو موضح لخلايا شوان.
بعد شفط الخلايا غير الملتزمة وغسل القارورة ، احتضن الخلايا بخمسة ملليلترات من الخلايا الليفية الطازجة متوسطة كاملة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. عندما تم استزراع الخلايا الأولية المعزولة في وسائط زراعة الخلايا المعنية ، وصلت الخلايا الكيراتينية الأولية إلى 85٪ من الالتقاء بحلول اليوم السابع وأظهرت مورفولوجيا خلوية مميزة ذات شكل مرصوف بالحصى. وصلت خلايا شوان إلى 95٪ من الالتقاء بحلول اليوم الخامس وظهرت ثنائية القطب أو ثلاثية القطب في الشكل.
وصلت مزارع الخلايا الليفية إلى 95٪ من الالتقاء بحلول اليوم الرابع وأظهرت معظم الخلايا مورفولوجيا شكل المغزل. أكد تلطيخ التألق المناعي تعبير البروتين المحدد لنوع الخلية في مزارع الخلايا. كانت الخلايا الكيراتينية إيجابية لبروتين K10 و K14.
أشارت الصور المدمجة للتألق المناعي للكيراتين والتلطيخ النووي DAPI إلى نقاء 97.8٪ من مزارع الخلايا. وبالمثل ، كانت خلايا شوان إيجابية ل S100 و P75 NTR وكان لها نقاء بنسبة 95.2٪ في الثقافة. عبرت الخلايا الليفية بشكل إيجابي عن vimentin ، ولكنها لم تعبر عن عضلة ألفا الملساء Actin ، وهي علامة myofibroblast.
كانت نقاء الثقافة حوالي 97.2٪ لتعزيز أدلة شانس ، يمكن استخدام طبق بولي إل ليسين المطلي مسبقا. ولزيادة التخفيف من التلوث الليفي ، تمت إضافة أرابينوسيد السيتوزين والعامل المضاد للفطريات بعد إضافة الخلايا لفترة قصيرة. هذا إجراء تجريبي بسيط غير مكلف لإنشاء الخلايا الأولية الثلاث ، مثل خلايا شوان ، والخلايا الكيراتينية ، والخلايا الليفية ، من جلد قلفة بشري واحد.
هذا البروتوكول مثالي للتجارب في المختبر التي تنطوي على اتصال الخلايا الخلوية أو الحديث المتبادل بين أنواع الخلايا.
