Кожа содержит несколько типов клеток, включая кератиноциты, фибробласты и нервные шванновские клетки. Этот протокол позволяет выделить каждый из этих типов клеток для экспериментов in vitro. Выделение и создание отдельных первичных клеточных культур от одного донора позволяет проводить надежные сравнения и эксперименты с кокультурами, одновременно смягчая последствия генетической изменчивости.
С помощью этого протокола анализ отдельных клеток и их взаимодействий позволяет проанализировать роль шванновских клеток в гомеостазе кожи и патофизиологии. Эти различные клеточные популяции могут быть использованы для изучения шванновских клеток, фибробластов или кератиноцитов по отдельности или в комбинации в нормальной физиологии кожи, заживлении ран или в болезненных состояниях кожи. Jagadeeshaprasad M G, постдокторант в моей лаборатории, будет помогать мне в демонстрации процедуры.
После приобретения крайней плоти новорожденного в соответствии со стандартными процедурами ухода поместите иссеченную крайнюю плоть в микроцентрифужную трубку, содержащую от восьми до 10 миллилитров ледяной базальной среды DMEM, и немедленно транспортируйте крайнюю плоть в лабораторию клеточной культуры для изоляции клеток. Дважды промойте крайнюю плоть 20-25 миллилитрами фосфатного буферного физиологического раствора Dulbecco или DPBS, содержащего антибиотики и антимикотические средства. Затем замочите вымытую кожу в 25-30 миллилитрах ледяной базальной среды DMEM в 10-сантиметровой чашке для культивирования тканей.
Через 15 минут разрезайте крайнюю плоть скальпелем, чтобы обнажить дерму и подкожную жировую клетчатку. Используйте щипцы, лезвие скальпеля и ножницы, чтобы удалить и отбросить подкожную жировую клетчатку. Затем разрежьте чистую крайнюю плоть на три-пять более мелких кусочков и высиживайте кусочки кожи в 16-20 миллилитрах Dispace одной среды DMEM в стерильной конической трубке.
В течение первых 30 минут инкубации с Dispace периодически смешивают кусочки кожи в конической трубке путем инверсии. Затем поместите коническую трубку при четырех градусах Цельсия на 16-18 часов. На следующий день удалите кусочки кожи и поместите их на сухую стерильную чашку для культивирования и разверните каждый кусочек кожи так, чтобы внешний слой эпидермиса касался чашки культуры.
Начиная с края ткани отшелушивают эпидермис от дермы с помощью двух наборов щипцов. Добавьте отделенные фрагменты эпидермиса к пяти миллилитрам HBS в 10-сантиметровую культуральную чашку для инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем собирают раствор HBS в коническую трубку объемом 50 миллилитров и добавляют пять миллилитров буфера нейтрализации трипсина или T и B в коническую трубку.
Отложите трубку в сторону. К эпидермальным фрагментам в культуральной посуде добавляют три миллилитра раствора трипсина для инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После инкубации осторожно перемешивают эпидермальные фрагменты щипцами до тех пор, пока раствор трипсина кератиноцитов не станет мутным.
Далее добавляют раствор трипсина кератиноцитов в трубку HBS T и B. После растворения непереваренных эпидермальных фрагментов раствором трипсина ЭДТА добавьте два миллилитра FBS в трубку HBS T и B, содержащую раствор трипсина ЭДТА, и центрифугируйте их примерно в 870 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем аспирируют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в трех миллилитрах кератиноцитарной полной питательной среды с последующей фильтрацией клеточной суспензии стерильным 100-микрометровым фильтром в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров.
Как только количество клеток и жизнеспособность клеток количественно определены, посейте клетки в культуральных пластинах, чтобы поместить их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислого газа. Через два дня аспирируйте неприлипшие клетки и обновляйте среду культивирования клеток через день, пока кератиноциты не достигнут 50-80% слияния для проходных или последующих экспериментов. Фляги Precoat T25 с поли-l-лизином или ФАПЧ, используя пять миллилитров DPBS и поместите предварительно покрытые колбы при 37 градусах Цельсия в течение трех часов.
Затем дважды промыть матрицу покрытия ФАПЧ с помощью DPBS. После промывания изолированных кусочков дермы пятью миллилитрами базальной среды ДМЭМ измельчите дерму на мелкие кусочки ножницами. Переваривайте измельченную дерму пятью миллилитрами коллагеназы при 37 градусах Цельсия в течение двух с половиной часов, с мягким титрованием с использованием наконечника пипетки каждые 30 минут, пока дерма полностью не диссоциирует.
После переваривания фильтруйте клеточную суспензию с помощью 70-микрометрового клеточного ситечка с последующим разбавлением фильтрованной клеточной суспензии пятью миллилитрами полной среды DMEM, чтобы остановить ферментативную активность коллагеназы. Затем центрифугируют суспензию ячейки в 870 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре и повторно суспендируют ячейку бюллетеня в двух миллилитрах DMEM полной среды для деления клеток. После повторения процесса центрификации, как описано, аспирируйте супернатант, чтобы использовать клеточную гранулу для выделения шванновских клеток или фибробластов.
Чтобы изолировать швановские клетки, повторно суспендируют клеточную гранулу в пяти миллилитрах свежей полной среды DMEM и количественно оценят количество клеток и жизнеспособность перед посевом пяти миллилитров повторно суспендированных клеток в предварительно закодированные колбы T25 с плотностью от 4,0 раз 10 до трех клеток на миллилитр. Инкубируйте колбу при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через 16 часов подтверждают адгезию клеток с помощью микроскопии при 10-кратном увеличении.
Затем удалите неадгезионные клетки и трижды промыть колбу пятью миллилитрами DPBS. Затем инкубируют клетки с пятью миллилитрами 10 микромолярного цитозина арабинозида в полной среде DMEM. Через 24 часа аспирируйте цитозинарабинозид, содержащую среду, прежде чем промывать колбу, как было показано ранее.
Наполните культуральную колбу пятью миллилитрами шванновских клеток полной питательной среды для инкубации 48 часов, одновременно обновляя среду через день, пока шванновские клетки не достигнут 80% конфлюзии. Чтобы выделить фибробласты, повторно суспендируют собранную гранулу в пяти миллилитрах фибробластов полной среды. Культивировать клетки в некодированных колбах для культивирования Т25 в течение 24 часов, как показано для шванновских клеток.
После аспирации неадгезивных клеток и промывки колбы, инкубируют клетки с пятью миллилитрами свежих фибробластов полной среды при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 48 часов. Поскольку изолированные первичные клетки культивировали в соответствующих клеточных культуральных средах, первичные кератиноциты достигали 85% слияния к седьмому дню и демонстрировали характерную морфологию клеток с булыжной формой. Шванновские клетки достигли 95% слияния к пятому дню и казались биполярными или триполярными по форме.
Культуры фибробластов достигли 95% слияния к четвертому дню, и большинство клеток демонстрировали морфологию формы веретена. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило экспрессию белка специфического типа клеток в клеточных культурах. Кератиноциты были положительными для белка K10 и K14.
Объединенные изображения иммунофлуоресценции кератина и ядерного окрашивания DAPI показали чистоту клеточных культур 97,8%. Аналогичным образом, шванновские клетки были положительными для S100 и P75 NTR и имели чистоту 95,2% в культуре. Фибробласты положительно экспрессировали виментин, но не экспрессировали альфа-гладкомышечный актин, маркер миофибробластов.
Чистота культуры составляла около 97,2% Чтобы усилить доказательства Shanse, можно использовать предварительно покрытое поли-l-лизиновое блюдо. А для дальнейшего смягчения волокнистого загрязнения цитозин арабинозид и антимикотический агент были добавлены после того, как клетки добавились в течение короткого времени. Это простая недорогая экспериментальная процедура для установления трех первичных клеток, таких как клетки шванна, кератиноциты и фибробласты, из одной передней кожи человека.
Этот протокол идеально подходит для экспериментов in vitro, включающих клеточную связь или перекрестные помехи между типами клеток.
